ISO 21528-2:2004

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count method

ISO 21528-2:2004 specifies a method, without pre-enrichment, for the enumeration of Enterobacteriaceae. It is applicable to products intended for human consumption and the feeding of animals, and environmental samples in the area of food production and food handling. Enumeration is carried out by counting colonies in a solid medium after incubation at 37 °C. This technique is recommended when the number of colonies sought is expected to be more than 100 per millilitre or per gram of the test sample.

Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour la recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae — Partie 2: Méthode par comptage des colonies

L'ISO 21528-2:2004 décrit une méthode pour le dénombrement des Enterobacteriaceae sans préenrichissement. Elle est applicable aux produits pour l'alimentation humaine et animale, et aux échantillons d'environnement pour la production et la distribution des aliments. Le dénombrement est effectué par comptage des colonies après incubation à 37 °C en milieu solide. Il est recommandé d'utiliser cette technique lorsque le nombre cherché est supposé être supérieur à 100 par millilitre ou par gramme d'échantillon soumis à essai.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 15-Aug-2004
• Withdrawal Date: 15-Aug-2004
• ICS: 07.100.01 - Microbiology in general
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 16-Jun-2017

Relations

• Revised: ISO 21528-2:2017 - Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique
• Effective Date: 02-Feb-2013
• Revises: ISO 7402:1993 - Microbiology — General guidance for the enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation — MPN technique and colony-count technique
• Effective Date: 15-Apr-2008
• Revises: ISO 8523:1991 - Microbiology — General guidance for the detection of Enterobacteriaceae with pre-enrichment
• Effective Date: 15-Apr-2008
• Revises: ISO 5552:1997 - Meat and meat products — Detection and enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation — MPN technique and colony-count technique
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21528-2
First edition
2004-08-15


Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal methods for the
detection and enumeration of
Enterobacteriaceae —
Part 2:
Colony-count method
Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour la recherche
et le dénombrement des Enterobacteriaceae —
Partie 2: Méthode par comptage des colonies





Reference number
ISO 21528-2:2004(E)
©
ISO 2004

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ISO 21528-2:2004(E)
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Published in Switzerland

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ISO 21528-2:2004(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 2
4.1 Preparation of initial suspension and decimal dilutions . 2
4.2 Isolation. 2
4.3 Confirmation. 2
4.4 Calculation. 2
5 Diluent, culture media and reagent . 3
6 Apparatus and glassware. 5
7 Sampling. 5
8 Preparation of test sample. 6
9 Procedure. 6
9.1 General. 6
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions . 6
9.3 Inoculation and incubation . 6
9.4 Counting and selection of colonies for confirmation . 6
9.5 Subculturing selected colonies. 7
9.6 Biochemical confirmation tests. 7
10 Expression of results. 7
11 Test report. 8
Annex A (normative) Confidence limits for the estimation of small numbers of colonies. 9
Bibliography . 10

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ISO 21528-2:2004(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21528-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
This first edition of ISO 21528-2, together with ISO 21528-1:2004, cancels and replaces the following
standards:
 ISO 5552:1997, Meat and meat products — Detection and enumeration of Enterobacteriaceae without
resuscitation — MPN technique and colony-count technique;
 ISO 7402:1993, Microbiology — General guidance for the enumeration of Enterobacteriaceae without
resuscitation — MPN technique and colony-count technique;
 ISO 8523:1991, Microbiology — General guidance for the detection of Enterobacteriaceae with pre-
enrichment.
ISO 21528 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae:
 Part 1: Detection and enumeration by MPN technique with pre-enrichment
 Part 2: Colony-count method
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ISO 21528-2:2004(E)
Introduction
This part of ISO 21528 is intended to provide general guidance for the examination of products not dealt with
by existing International Standards and to be taken into account by organizations preparing microbiological
test methods for application to foods or animal feeding stuffs. Because of the large variety of products within
this field of application, these guidelines may not be appropriate in every detail for certain products, and for
some other products it may be necessary to use different methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases
every attempt will be made to apply the guidelines provided as far as possible and that deviations from them
will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this part of ISO 21528 is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which the guidelines have been followed and the reasons for deviation from them in the case of
particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is
hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this part of ISO 21528 so
that eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for well-
established technical reasons.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21528-2:2004(E)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
methods for the detection and enumeration of
Enterobacteriaceae —
Part 2:
Colony-count method
1 Scope
This part of ISO 21528 specifies a method, without pre-enrichment, for the enumeration of Enterobacteriaceae.
It is applicable to
 products intended for human consumption and the feeding of animals, and
 environmental samples in the area of food production and food handling.
1)
Enumeration is carried out by counting colonies in a solid medium after incubation at 37 °C (or 30 °C) .
This technique is recommended when the number of colonies sought is expected to be more than 100 per
millilitre or per gram of the test sample.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1 : General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 6887-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 2: Specific rules for the preparation of meat and
meat products
ISO 6887-3, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 3: Specific rules for the preparation of fish and
fishery products
ISO 6887-4, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 4: Specific rules for the preparation of products
other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products

1) The temperature of 37 °C is generally used when the enumeration of Enterobacteriaceae is for a hygienic indicator.
Alternatively, a temperature of 30 °C can be chosen when the enumeration of Enterobacteriaceae is conducted for
technological purposes and includes psychrotrophic Enterobacteriaceae.
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ISO 21528-2:2004(E)
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological
examinations, and Amendment 1:2001.
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examination
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and
production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions appl
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21528-2
Première édition
2004-08-15



Microbiologie des aliments — Méthodes
horizontales pour la recherche et le
dénombrement des
Enterobacteriaceae —
Partie 2:
Méthode par comptage des colonies
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal methods
for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae —
Part 2: Colony-count method





Numéro de référence
ISO 21528-2:2004(F)
©
ISO 2004

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ISO 21528-2:2004(F)
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Publié en Suisse

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ISO 21528-2:2004(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 2
4.1 Préparation de la suspension initiale et des dilutions décimales . 2
4.2 Isolement. 2
4.3 Confirmation. 2
4.4 Calcul. 2
5 Diluants, milieux de culture et réactifs . 3
6 Appareillage et verrerie. 5
7 Échantillonnage. 5
8 Préparation de l'échantillon soumis à l'essai . 6
9 Mode opératoire. 6
9.1 Généralités. 6
9.2 Prise d'essai, suspension-mère et dilutions . 6
9.3 Ensemencement et incubation . 6
9.4 Comptage et sélection des colonies pour confirmation. 7
9.5 Repiquage des colonies sélectionnées . 7
9.6 Essais de confirmation biochimique . 7
10 Expression des résultats. 7
11 Rapport d'essai. 8
Annexe A (normative) Limites de confiance des estimations des petits nombres de colonies . 9
Bibliographie . 10

© ISO 2004 – Tous droits réservés iii

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ISO 21528-2:2004(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
Cette première édition de la présente partie de l'ISO 21528, ensemble avec l'ISO 21528-1, annulent et
remplacent les normes suivantes:
 ISO 5552:1997, Viande et produits à base de viande — Recherche et dénombrement des
Enterobacteriaceae sans ressuscitation — Technique de NPP et technique de comptage de colonies;
 ISO 7402:1993, Microbiologie — Directives générales pour le dénombrement sans revivification des
Enterobacteriaceae — Technique NPP et méthode par comptage des colonies;
 ISO 8523:1991, Microbiologie — Directives générales pour la recherche des Enterobacteriaceae avec
pré-enrichissement.
L'ISO 21528-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
L'ISO 21528 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments —
Méthodes horizontales pour la recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae:
 Partie 1: Recherche et dénombrement à l'aide de la technique NPP avec préenrichissement
 Partie 2: Méthode par comptage des colonies
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ISO 21528-2:2004(F)
Introduction
La présente partie de l'ISO 21528 se propose de fournir des directives générales pour l'examen des produits
non concernés par les Normes internationales existant actuellement et devant être prises en compte en
considération par les organismes élaborant des méthodes d'essai microbiologiques destinées à être
appliquées à des aliments. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce domaine
d'application, il est possible que ces directives, dans tout leur détail, ne conviennent pas à certains produits et
que, pour certains autres produits, il soit nécessaire d'employer des méthodes différentes. Néanmoins, il est à
espérer que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu'il sera possible, les
directives données et qu'on n'aura recours à des dérogations que si cela est absolument nécessaire pour des
raisons techniques.
Lorsque la présente partie de l'ISO 21528 sera réexaminée, il sera tenu compte de tous les renseignements
disponibles à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure les directives auront été suivies et les raisons pour
lesquelles il aura été nécessaire d'y déroger dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut pas être immédiate et, pour certains groupes de produits, des
Normes internationales et/ou des normes nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec la
méthode horizontale décrite dans le présent document. Il serait souhaitable que lorsque ces normes viendront
en révision, elles soient modifiées de façon à se conformer à la présente partie de l'ISO 21528 si bien que,
finalement, les seules divergences restant seront celles nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.

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NORME INTERNATIONALE ISO 21528-2:2004(F)

Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour la
recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae —
Partie 2:
Méthode par comptage des colonies
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 21528 décrit une méthode pour le dénombrement des Enterobacteriaceae sans
préenrichissement. Elle est applicable
 aux produits pour l'alimentation humaine et animale, et
 aux échantillons d'environnement pour la production et la distribution des aliments.
1)
Le dénombrement est effectué par comptage des colonies après incubation à 37 °C (ou 30 °C) en milieu
solide.
Il est recommandé d'utiliser cette technique lorsque le nombre cherché est supposé être supérieur à 100 par
millilitre ou par gramme d'échantillon soumis à essai.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887-1:1999, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 6887-2, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 2: Règles spécifiques pour la préparation
des viandes et produits à base de viande
ISO 6887-3, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 3: Règles spécifiques pour la préparation
des produits de la pêche
ISO 6887-4, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation de
produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche

1) En général, on choisi l'incubation à 37°C lorsque les entérobactéries sont recherchées en tant qu'indicateur d'hygiène.
Alternativement, la température de 30°C peut être choisie lorsque le dénombrement des entérobactéries est entreprise
dans le cadre d'un procédé technologique et comprend les entérobactéries psychrotrophe.
© ISO 2004 – Tous droits réservés 1

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ISO 21528-2:2004(F)
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques, et
Amendement 1:2001
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
ISO/TS 11133-2, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Enterobacteriaceae
microorganismes formant des colonies caractéristiques sur gélose au cristal violet, à la bile et au glucose,
fermentant le glucose et donnant une réaction oxydase négative lorsque les essais sont effectués se
...