ISO 7402:1993
(Main)Microbiology — General guidance for the enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation — MPN technique and colony-count technique
Microbiology — General guidance for the enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation — MPN technique and colony-count technique
Gives general guidance for the enumeration of Enterobacteriaceae present in products intended for human consumption or animal feeding stuffs: 1) by calculation of the most probable number after incubation at 35 °C or 37 °C in liquid medium (MPN technique), or 2) by counting colonies in a solid medium after incubation at 35 °C or 37 °C (colony-counting technique). For low numbers, the MPN method is preferable, otherwise the colony-count method is preferred.
Microbiologie — Directives générales pour le dénombrement sans revivification des Enterobacteriaceae — Technique NPP et méthode par comptage des colonies
La présente Norme internationale donne des directives générales pour le dénombrement des Enterobacteriaceae dans les produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale -- par calcul du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 35 °C ou 37 °C en milieu liquide; -- par comptage des colonies obtenues en milieu solide après incubation à 35 °C ou 37 °C. La température utilisée doit faire l'objet d'un accord entre les parties concernées et doit être mentionnée dans le rapport d'essai. NOTE 1 Dans le cas des produits réfrigérés et congelés, une température d'incubation de 30 °C est recommandée, notamment lorsque le dénombrement est effectué dans un but technologique. Pour les petits nombres, la technique NPP est préférable, sinon on préférera la méthode par comptage des colonies. La présente Norme internationale n'inclut pas de technique de revivification, et les résultats ne doivent pas être reliés aux critères ou spécifications basés sur la supposition qu'une revivification a été effectuée. Des limites sont imposées aux possibilités d'application de la présente Norme internationale, du fait que ces méthodes sont sujett 168es à de grandes variations. Il est recommandé d'employer ces méthodes et d'interpréter les résultats à la lumière des renseignements donnés en 10.3.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
ISO
INTEWNATIONAL
7402
STANDARD
Second edition
1993-09-15
- General guidance for the
Microbiology
enumeration of Enterobacteriaceae
without resuscitation - MPN technique
and colony-count technique
- Directives g&Grales pour Ie denombrement sans
Microbiologie
- Technique NPP et methode par
revivification des Enterobacteriaceae
comp tage des colonies
Reference number
ISO 7402:1993(E)
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ISO 7402:1993(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(1 . EC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 7402 was prepared by Technical Committee
ISOnC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 9,
Microbiolog y.
This second edition cancels and replaces the first edition
(ISO 7402:1985), which has been technically revised.
Annexes A and B form an integral part of this International Standard.
0 ISO 1993
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form or
by any means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without per-
mission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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ISO 7402:1993(E)
Introduction
This Internationai Standard is intended to provide general guidance for the
examination of products not dealt with by existing International Standards
and to be taken into account by organizations preparing microbiological
methods of test for application to foods or to animal feeding stuffs. Be-
cause of the large variety of products within this field of application, these
guidelines may not be appropriate in every detail for certain products, and
for some other products it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to
apply the guidelines provided as far as possible and that deviations from
them will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which the guide-
lines have been followed and the reasons for deviation from them in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
groups of products, International Standards and/or national Standards may
already exist that do not comply with these guidelines. In cases where
International Standards already exist for the product to be tested, they
should be followed, but it is hoped that when such Standards are reviewed
they will be changed to comply with this International Standard so that
eventtially the only remaining departures from these guidelines will be
those necessary for weil-established technical reasons.
For any particular prodtict the method to be used will be specified in the
International Standard dealing with that product.
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This page intentionatly lefi blank
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 7402:1993(E)
Microbiology - General guidance for the enumeration
of Enferobacteriaceae without resuscitation - MPN
technique and colony-count technique
are subject to revision, and Parties to agreements
1 Scope
based on this International Standard are encouraged
to investigate the possibility of applying the most re-
This International Standard gives general guidance for
cent editions of the Standards indicated below.
the enumeration of Enterobacteriaceae present in
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
products intended for human consumption or animal
rently valid International Standards.
feeding stuffs:
ISO 6887: 1983, Microbiology - General guidance for
- by calculation of the most probable number (MPN)
the preparation of dilutions for microbiological exam-
after incubation at 35 “C or 37 “C in liquid medium,
ina tion.
or
ISO 7218: 1985, Microbiology - General guidance for
- by counting colonies in a solid medium after incu-
microbiological examina tions.
bation at 35 “C or 37 “C.
The temperature used is to be the subject of agree-
3 Definitions
ment between the Parties concerned, and is to be
stated in the test report.
For the purposes of this International Standard, the
following definitions apply.
NOTE 1 In the case of frozen foods, an incubation tem-
perature of 30 “C is preferred when the aim of the enu-
3.1 Enferobacteriaceae: Microorganisms which
meration is technological.
ferment glucose and show a negative oxidase re-
action when the test is carried out according to the
For low numbers, the MPN method is preferable,
method specified.
otherwise the colony-count method is preferred.
This International Standard does not include resusci- 3.2 count of hterobacteriaceae: The number sf
tation procedures and the results should not, there- Enterobacteriaceae found per millilitre or per gram of
fore, be related to criteria or specifications based on the test Sample when the test is carried out according
the assumption that resuscitation has been carried to the method specified.
out.
4 Principle
A limitation on the applicability of this International
Standard is imposed by the susceptibility of the
methods to a large degree of variability. The methods
4.1 Preparation of dilutions
should be used and the results interpreted in the light
of the information given in 10.3.
Preparation of decimal dilutions from the test Sample.
4.2 Enumeration of Enferobactehceae
2 Normative references
4.2.ll Most probable number (MPN) technique
The following Standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
NOTE 2 This technique is recommended when the num-
of this International Standard. At the time of publi-
ber sought is expected to be in the range 1 to 100 per
cation, the editions indicated were valid. All Standards
millilitre or per gram of the test Sample.
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ISO 7402:1993(E)
Inoculation of three tubes of dcuble-strength medium 5.3 Culture media
with a specified quantity of test Sample if the product
is liquid, or with a specified quantity of the initial sus-
Buffered brilliant green bile glucose broth
Pension in the case of other products. 5.3.1
(E.E. broth)
Inoculation of three tubes of Single-strength medium
with a specified quantity of the test Sample if the
5.3.1 .l Composition
product is liquid, or with a specified quantity of the
initial Suspension in the case of other products. Then,
under the same conditions, inoculation of three tubes
d b)
of Single-strength medium with the first decimal di-
Double-strength Single-strength
lution of the test Sample or of the initial Suspension.
medium medium
Incubation of the tubes at 35 “C or 37 “C (as agreedj
Peptone IO,0 g
2ao g
for 24 h.
Glucose
IO,0 g 5,o g
From the number of confirmed positive tubes, calcu-
Disodium hydrogen
Phosphate (Na,HPO,) 12,90 g
lation of the most probable number of Entero- 645 g
bacteriaceae per millilitre or per gram of the test
Potassium dihydrogen
Phosphate (KH,PO,)
Sample using the MPN table (see annex A). 4,o g zo g
Ox bile, dehydrated
4w g 2w g
Brilliant green 0,030 g 0,015 g
4.2.2 Colony-count technique
Water 1 000 ml 1 000 ml
NOTE 3 This technique is recommended when the num-
ber sought is expected to be greater than 100 per millilitre
or per gram of the test Sample.
5.3.1.2 Preparation
Inoculation of violet red bile glucose agar contained in
Dissolve the components or the dehydrated complete
two Petri dishes (poured-plate technique) with a
medium in the water by boiling. DO not heat the me-
specified quantity of the test Sample if the initial
dium for longer than 30 min. Cool the medium rapidly.
product is liquid, or with a specified quantity of the
initial Suspension in the case of other products.
Adjust the pH, if necessary, so that after boiling it is
Covering with an overlayer of the same medium. 7,2 at 25 “C.
Preparation of other pairs of plates under the same
Transfer 10 ml portions to sterile tubes or bottles
conditions, using decimal dilutions of the test Sample
(6.8).
or of the initial Suspension.
DO not autoc!ave the medium.
Incubation of the dishes at 35 “C or 37 “C (as agreedj
The medium may be stored for up to 1 week at 0 “C
for 24 h + 2 h.
to 5 “C.
Calculation of the number of Enterohacteriaceae per
millilitre or per gram of the test Sample from the 5.3.2 Violet red bile gluccse ac;ar (VRBG)
number of confirmed typical colonies per dish.
5.3.2.1 Composition
5 Diktion fluid, culture media and
reagent
- ;:;i
Glucose 10.0 g
5.1 General
Sodium chloride 5s) g
Neutral red W3 g
For current laboratory practice, see SO 7218.
Crystal violet 0,002 g
Agar in powder cr flake form 8tol8g’)
5.2 Diktion fluid VVater 1 000 ml
See ISO 6887 and any specific Standard dealing with
1) Depending on the gel strength of the agar.
the product to be examined.
2
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ISO 7402:1993(E)
5.3.2.2 Preparation Leave the tubes or flasks in a vertical Position.
The medium may be stored for up to 1 week at 0 “C
Dissolve the components or the dehydrated complete
to 5 “C.
medium in the water by boiling. DO not heat the me-
dium for more than 30 min.
Sust beforz use, heat in boiling water or flowing
steam for 15 min, then cool rapidly to the incubation
Adjust the pH, if necessary, so that after boiling it is
tvmperature.
7,4 at 25 “C.
Transfer the culture medium to sterile tubes, flasks
5.3.4 Nutrient agar
or bottles (6.8) of capacity not more than 500 ml.
DO not autoclave the medium.
5.3.4.1 Composition
Prepare this medium just before use (see 9.2.2 and
9.3.1).
Beef extract
3,o g
Peptone
5,o g
5.3.2.3 Preparation of agar plates (required only
Agar in powder or in flake form 8to 18g’)
for MPN technique, see 9.2.2)
Water 1 000 ml
Dispense immediately approximately 15 ml of the
culture medium, cooled to approximately 45 “C, into
1) Depending on the get strength of the agar.
Petri dishes (6.6) and allow to solidify.
Immediately before use, dry the plates, preferably
with the lids off and the agar surface downwards, in 5.3.4.2 Preparation
the oven (6.3) until the agar surface is dry.
Dissolve the components or dehydrated complete
If prepared in advance, the undried plates shall not be
medium in the water by heating, if necessary.
kept for longer than 4 h at room temperature or 1 day
at 0 “C to 5-“C. Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
it is 7,0 at 25 “C.
,
5.3.3 Glucose agar
Transfer the culture medium to tubes, bottles or
flasks (6.8) of capacity not more than 500 ml.
5.3.3.1 Composition
Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 “C + 1 “C for
-
15 min.
Tryptone
IO,0 g
5.3.4.3 Preparation of agar plates (see 9.4.1)
Yeast extract
L5 g
Glucose
no g
Transfer immediately about 15 ml of the culture me-
Sodium chloride
510 g dium, melted and cooled to approximately 45 “C, to
Petri dishes (6.6) and allow to solidify.
Bromocresol purple
0,015 g
Agar in powder or flake form 8gto18g’)
Just before use, dry the plates, preferably with the
Water 1 000 ml
lids off and the agar surface downwards, in the oven
(6.3), until the agar surface is dry.
1) Depending on the gel strength of the agar.
If prepared in advance, the undried plates shall not be
kept for longer than 4 h at room temperature or 1 day
at 0 “C to 5 “C.
5.3.3.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete
5.4 Oxidase reagent
medium in the water by heating, if necessary.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
5.4.1 Composition
it is 7,0 at 25 “C.
Dispense the culture medium in quantities of 15 ml
N,N,N’,IFTetramethyl-pphenylene-
into tubes or flasks (6.8).
diamine dihydrochloride
1,o g
Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at Water 100 ml
121 “C.
3
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ISO 7402:1993(E)
5.4.2 Preparation
8 Preparation of test Sample
Dissolve the reagent in the cold water.
Prepare the test Sample in accordance with the spe-
cific International Standard appropriate to the product
Prepare the reagent just before use.
concerned. If there is no specific International Stan-
dard, it is recommended that the Parties concerned
come to an agreement on this subject.
6 Apparatus and glassware
4
NOTE Disposable apparatus is an acceptable alterna-
9 Procedure
tive to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological labo ratory equipment and, in
9.‘il Test Portion, initial Suspension and
particu lar, the following.
dilutions
Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
6.1 See ISO 6887 and any specific International Standard
appropriate to the product concerned.
sterilization (autoclave)
Prepare a Single decimal dilution series from the test
See ISO 7218.
Sample if the product is liquid, or from the initial sus-
pension in the case of other products.
6.2 Incubator, capable of operating at 35 “C + 1 “C
-
or at 37 “C + 1 OC.
-
9.2 MPN technique
6.3 Drying cabinet or incubator, capable of oper-
ating between 35 “C + 1 “C and 55 “C + 1 “C.
- 9.2.1 Inoculation and incubation
Take three tubes of double-strength m
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 7402
Deuxième édition
1993-09-15
Microbiologie - Directives générales pour
le dénombrement sans revivification des
- Technique NPP et
Enterobacteriaceae
méthode par comptage des colonies
Microbiology - General guidance for the enumeration of
Enterobacteriaceae without resuscitation - MPN technique and
colony-Count technique
Numéro de référence
ISO 7402:1993(F)
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ISO 7402:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une féderation
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7402 a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7402:1985), qui fait l’objet d’une révision technique.
s A et B font partie intégrante de la présente Norme intema-
Les annexe
tionale.
0 60 1993
Droits de reproduction réserves. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit. et par aucun procedé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord ecrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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ISO 7402:1993(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernés par les Normes
internationales existant actuellement, et a prendre en considération par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques destinées
a être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments pour ani-
maux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce do-
maine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement a certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des métho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, ces
directives, et qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela est ab-
solument nécessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront été suivies et les raisons pour
lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
normes nationales, qui ne concordent pas avec ces directives, existent
peut-être déjà. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà
pour le produit à essayer, elles devront être appliquées, mais il serait
souhaitable que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient alignées
sur la présente Norme internationale, si bien que, finalement, les seules
divergences restantes seront celles qui sont nécessaires pour des raisons
techniques bien établies.
dans la
Pour chaque produit particulier, la méthode a utiliser sera précisée
Norme internationale concernant ce produit.
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 7402:1993(F)
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement sans revivification des
Enterobacteriaceae - Technique NPP et méthode par
comptage des colonies
tuent des dispositions valables pour la présente
1 Domaine d’application
Norme internationale. Au moment de la publication,
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
La présente Norme internationale donne des directi-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
ves générales pour le dénombrement des fntero-
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
bacteriaceae dans les produits destinés a la
nale sont invitées a rechercher la possibilité d’appli-
consommation humaine ou à l’alimentation animale
quer les editions les plus récentes des normes
indiquées ci-aprés. Les membres de la CEI et de I’ISO
- par calcul du nombre le plus probable (NPP) après
possèdent le registre des Normes internationales en
incubation à 35 “C ou 37 “C en milieu liquide;
vigueur à un moment donné.
- par comptage des colonies obtenues en milieu
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
solide aprés incubation à 35 “C ou 37 “C.
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
La température utilisée doit faire l’objet d’un accord microbiologique.
entre les parties concernees et doit être mentionnée
dans le rapport d’essai. ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
pour les examens microbiologiques.
NOTE 1 Dans le cas des produits réfrigérés et congelés,
une température d’incubation de 30 “C est recommandée,
notamment lorsque le dénombrement est effectué dans un
3 Définitions
but technologique.
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
Pour les petits nombres, la technique NPP est préfé-
les définitions suivantes s’appliquent.
rable, sinon on préférera la méthode par comptage
des colonies.
3.1 Enterobacferr’aceae: Micro-organismes fermen-
tant le glucose et donnant une réaction oxydase né-
La présente Norme internationale n’inclut pas de
gative lorsque l’essai est effectué selon la méthode
technique de revivification, et les résultats ne doivent
spécifiée.
pas être reliés aux critères ou spécifications basés sur
la supposition qu’une revivification a été effectuée.
3.2 dénombrement des Enterobacteriaceae:
Des limites sont imposées aux possibilités d’applica-
Nombre d’hterobacteriaceae trouvé par millilitre ou
tion de la présente Norme internationale, du fait que par gramme d’échantillon lorsque l’essai est effectué
ces méthodes sont sujettes à de grandes variations. selon la methode spécifiée.
II est recommandé d’employer ces méthodes et d’in-
terpréter les resultats à la lumière des rensei-
gnements donnés en 10.3.
4 Principe
2 Références normatives
4.1 Préparation des dilutions
Les normes suivantes contiennent des dispositions
À partir de l’échantillon pour essai, préparation des
qui, par suite de la réference qui en est faite, consti-
dilutions décimales.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 7402:1993(F)
4.2 Dénombrement des Enferobacferiaceae
5 Diluant, milieux de culture et réactif
4.2.1 Technique du nombre le plus probable
5.1 Généralités
WW
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
NOTE 2 II est recommandé d’utiliser cette technique
I’ISO 7218.
lorsque le nombre c.herché est supposé se trouver dans
l’intervalle de 1 à 100 par millilitre ou par gramme d’échan-
tillon pour essai.
5.2 Diluant
Ensemencement de trois tubes de milieu double
concentration avec une quantité déterminee de
Voir I’ISO 6887 et la norme spécifique traitant du
l’échantillon pour essai si le produit à examiner est li-
produit à analyser.
quide, ou avec une quantité determinee de suspen-
sion mére dans le cas d’autres produits.
Ensemencement de trois tubes de milieu simple
concentration avec une quantité determinée de
5.3 Milieux de culture
l’echantillon pour essai si le produit à examiner est li-
quide, ou avec une quantité determinée de suspen-
sion mère dans le cas d’autres produits, puis, dans les
53.1 Milieu tamponné, à la bile, au vert brillant
mêmes conditions, ensemencement de trois tubes
et au glucose (milieu E.E.)
de milieu simple concentration avec la première dilu-
tion decimale obtenue à partir de l’échantillon pour
essai ou de la suspension mère.
5.3.1 .l Composition
Incubation des tubes à 35 “C ou 37 “C (selon accord)
pendant 24 h.
a) b)
Milieu simple
Milieu double
À partir du nombre de tubes confirmes positifs, calcul
concentration concentration
du nombre le plus probable d’Enterobacteriaceae par
millilitre ou par gramme d’échantillon pour essai au
Peptone 20,o g lao g
moyen de la table NPP (voir annexe A).
Glucose lOtO g 5,o g
Hydrogénophosphate
disodique (Na,HPO,) 12,90 g
645 g
Dihydrogénophosphate
4.2.2 Comptage des colonies
de potassium KH2P0,)
4,o g zo g
NOTE 3 II est recommandé d’utiliser cette technique Bile de boeuf
déshydratée
lorsque le nombre cherché est supposé supérieur à 100 par 40 g mo g
millilitre ou par gramme d’échantillon pour essai.
Vert brillant 0,030 g 0,015 g
Eau 1 000 ml 1 000 ml
Ensemencement en profondeur du milieu gélosé à la
bile, au cristal violet et au glucose, coule dans deux
boîtes de Petri, avec une quantité determinée de
l’échantillon pour essai si le produit à examiner est li-
5.3.1.2 Préparation
quide, ou avec une quantité determinée de la sus-
pension mère dans le cas d’autres produits.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
Recouvrement avec une couche du même milieu.
hydrate dans l’eau, en portant le tout à Abullition. Ne
pas chauffer le milieu plus de 30 min. Refroidir le mi-
Dans les mêmes conditions, ensemencement d’au-
lieu rapidement.
tres paires de boîtes avec les dilutions decimales ob-
tenues a partir de l’echantillon pour essai ou de la
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après ébulli-
suspension mère.
tion, il soit de 7,2 à 25 “C.
Incubation des boîtes à 35 “C ou 37 “C (selon accord)
Repartir le milieu de culture par quantités de 10 ml
pendant 24 h & 2 h.
dans des tubes stériles (6.8).
À partir du nombre de colonies caractéristiques
Ne pas stériliser le milieu a l’autoclave.
confirmées par boîte de Petri, calcul du nombre
d’Enterobacteriaceae par millilitre ou par gramme Le milieu peut être conserve 1 semaine au maximum
d’échantillon pour essai.
entre 0 OC et 5 OC.
2
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ISO 7402:1993(F)
Gélose à la bile, au cristal violet et au 5.3.3 Gélose glucosée
5.3.2
glucose (VRBG)
5.3.3.1 Composition
5.3.2.1 Composition
Tryptone
lO,O g
Extrait de levure 1’5 g
Glucose
IW g
Peptone
7’0 g
Chlorure de sodium 5’0 g
Extrait de levure
3’0 g
Pourpre de bromocrésol 0,015 g
Sels biliaires
1’5 g
Agar-agar 8g à18g')
Glucose
lao g
1 000 ml
Eau
Chlorure de sodium
5’0 g
Rouge neutre
0’03 g
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Cristal violet 0,002 g
Agar-agar, en poudre ou en flocons 8à18g’)
Eau 1 000 ml
5.3.3.2 PrBparation
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
hydrate dans l’eau, en chauffant si necessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
sation, il soit de 7,0 à 25 OC.
5.3.2.2 Préparation
Repartir le milieu de culture par quantités de 15 ml
dans des tubes (6.8).
Dissoudre les composants ou le milieu complet des-
hydrate dans l’eau, en portant le tout à ebullition. Ne
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglée à 121 “C pendant
pas chauffer le milieu plus de 30 min.
15 min.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après ébulli-
Maintenir les tubes en position verticale.
tion, il soit de 7,4 à 25 “C.
Le milieu peut être conserve 1 semaine au maximum
entre 0 OC et 5 OC.
Repartir le milieu de culture dans des tubes stériles
ou dans des flacons steriles (6.5) de 500 ml de capa-
Juste avant l’emploi, chauffer dans de l’eau bouillante
cite maximale.
ou sous courant de vapeur pendant 15 min, puis re-
froidir rapidement à la température d’incubation.
Ne pas steriliser le milieu a l’autoclave.
Préparer ce milieu extemporanément (voir 9.2.2 et
5.3.4 Gelose nutritive
9.3.1).
5.3.4.1 Composition
5.3.2.3 Prdparation des boîtes de gelose
Extrait de viande de boeuf
(seulement nécessaire pour la technique NPP - voir 3’0 4
9.2.2)
54 g
Peptone
8a18g’)
Agar-agar, en poudre ou flocons
Transférer immediatement environ 15 ml du milieu de
Eau 1 000 ml
culture, refroidi à environ 45 OC, dans des boîtes de
Petri (6.3) et laisser se solidifier.
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Juste avant l’emploi, secher les boîtes de gélose, de
préférence avec le couvercle enleve et la surface de
la gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3)
5.3.4.2 Préparation
jusqu’à séchage de la surface de la gélose.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
Si elles ont été préparées à l’avance, les boîtes de
hydrate dans l’eau, en chauffant si necessaire.
gélose non sechées ne doivent pas être conservees
plus de 4 h à la température ambiante ou plus d’un Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
jour entre 0 “C et 5 OC. sation, il soit de 7,0 a 25 “C.
---------------------- Page: 7 ----------------------
Réparti r le milieu de c ulture dans ou des 6.4 pH-mètre, précis à rt: 0,l unité pH à 25 “C.
des tubes
flacons (6.8) de 500 ml de capacité maximale.
6.5 Bain d’eau, ou dispositif similaire, réglable à
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglée à 121 “C durant
45 “C + 1 "C.
-
15 min.
6.6 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plasti-
5.3.4.3 Préparation des boîtes de gélose (voir
que, de diametre 90 mm a 100 mm.
9.4.1)
Transférer immédiatement environ 15 ml du milieu de
6.7 Anse bouclée, d’un diamètre d’environ 3 mm,
culture, puis refroidir à environ 45 “C, dans des boîtes
et fil droit en platine iridié ou en nickel-chrome, ou
de Petri (6.6) et laisser se solidifier.
baguette de verre ou anse bouclée à usage unique.
Juste avant l’emploi, sécher les boîtes de gélose, de
NOTE 5 Le nickel-chrome ne convient pas pour l’essai à
préférence avec le couvercle enlevé et la surface de
l’oxydase (voir 9.4.2.1).
la gélose tournee vers le bas, dans une etuve (6.3)
jusqu’à séchage de la surface de la gélose.
dimensions
6.8 Tubes à essai, de
Si elles ont été préparées à l’avance, les boîtes de
16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm environ, et
gélose non séchées ne doivent pas être conservées
flacons ou fioles, de capacité comprise entre 150 ml
plus de 4 h à la température ambiante ou plus d’un
et 500 ml.
jour entre 0 “C et 5 “C.
6.9 Pipettes graduées à écoulement total, de ca-
5.4 Réactif pour l’essai à l’oxydase pacités nominales de 1 ml et 10 ml, graduées res-
pectivement en 0,l ml et 0,5 ml.
5.4.1 Composition
7 Échantillonnage
Dichlorhydrate de N,N,N’,N’ -
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
tétraméthyl-p-phénylène diamine
1’0 g
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
Eau 100 ml
modifié lors du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
spécifiée dans la présente Norme internationale. S’il
5.4.2 Préparation
n’existe pas de Norme internationale spécifique à
l’échantillonnage du produit concerné, il est recom-
Dissoudre le réactif dans l’eau froide.
mandé que les parties concernées se mettent d’ac-
cord à ce sujet.
Préparer le réactif immédiatement avant usage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6 Appareillage et verrerie
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
NOTE 4 Le matériel à usage unique est acceptable au
Norme internationale spécifique du produit concerné.
même titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
sont similaires.
il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et
notamment:
9 Mode opératoire
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche
(four) ou en chaleur humide (autoclave)
9.1 Prise d’essai, suspension
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 7402
Deuxième édition
1993-09-15
Microbiologie - Directives générales pour
le dénombrement sans revivification des
- Technique NPP et
Enterobacteriaceae
méthode par comptage des colonies
Microbiology - General guidance for the enumeration of
Enterobacteriaceae without resuscitation - MPN technique and
colony-Count technique
Numéro de référence
ISO 7402:1993(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 7402:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une féderation
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7402 a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7402:1985), qui fait l’objet d’une révision technique.
s A et B font partie intégrante de la présente Norme intema-
Les annexe
tionale.
0 60 1993
Droits de reproduction réserves. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit. et par aucun procedé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord ecrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 7402:1993(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernés par les Normes
internationales existant actuellement, et a prendre en considération par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques destinées
a être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments pour ani-
maux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce do-
maine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement a certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des métho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, ces
directives, et qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela est ab-
solument nécessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront été suivies et les raisons pour
lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
normes nationales, qui ne concordent pas avec ces directives, existent
peut-être déjà. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà
pour le produit à essayer, elles devront être appliquées, mais il serait
souhaitable que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient alignées
sur la présente Norme internationale, si bien que, finalement, les seules
divergences restantes seront celles qui sont nécessaires pour des raisons
techniques bien établies.
dans la
Pour chaque produit particulier, la méthode a utiliser sera précisée
Norme internationale concernant ce produit.
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 7402:1993(F)
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement sans revivification des
Enterobacteriaceae - Technique NPP et méthode par
comptage des colonies
tuent des dispositions valables pour la présente
1 Domaine d’application
Norme internationale. Au moment de la publication,
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
La présente Norme internationale donne des directi-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
ves générales pour le dénombrement des fntero-
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
bacteriaceae dans les produits destinés a la
nale sont invitées a rechercher la possibilité d’appli-
consommation humaine ou à l’alimentation animale
quer les editions les plus récentes des normes
indiquées ci-aprés. Les membres de la CEI et de I’ISO
- par calcul du nombre le plus probable (NPP) après
possèdent le registre des Normes internationales en
incubation à 35 “C ou 37 “C en milieu liquide;
vigueur à un moment donné.
- par comptage des colonies obtenues en milieu
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
solide aprés incubation à 35 “C ou 37 “C.
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
La température utilisée doit faire l’objet d’un accord microbiologique.
entre les parties concernees et doit être mentionnée
dans le rapport d’essai. ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
pour les examens microbiologiques.
NOTE 1 Dans le cas des produits réfrigérés et congelés,
une température d’incubation de 30 “C est recommandée,
notamment lorsque le dénombrement est effectué dans un
3 Définitions
but technologique.
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
Pour les petits nombres, la technique NPP est préfé-
les définitions suivantes s’appliquent.
rable, sinon on préférera la méthode par comptage
des colonies.
3.1 Enterobacferr’aceae: Micro-organismes fermen-
tant le glucose et donnant une réaction oxydase né-
La présente Norme internationale n’inclut pas de
gative lorsque l’essai est effectué selon la méthode
technique de revivification, et les résultats ne doivent
spécifiée.
pas être reliés aux critères ou spécifications basés sur
la supposition qu’une revivification a été effectuée.
3.2 dénombrement des Enterobacteriaceae:
Des limites sont imposées aux possibilités d’applica-
Nombre d’hterobacteriaceae trouvé par millilitre ou
tion de la présente Norme internationale, du fait que par gramme d’échantillon lorsque l’essai est effectué
ces méthodes sont sujettes à de grandes variations. selon la methode spécifiée.
II est recommandé d’employer ces méthodes et d’in-
terpréter les resultats à la lumière des rensei-
gnements donnés en 10.3.
4 Principe
2 Références normatives
4.1 Préparation des dilutions
Les normes suivantes contiennent des dispositions
À partir de l’échantillon pour essai, préparation des
qui, par suite de la réference qui en est faite, consti-
dilutions décimales.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 7402:1993(F)
4.2 Dénombrement des Enferobacferiaceae
5 Diluant, milieux de culture et réactif
4.2.1 Technique du nombre le plus probable
5.1 Généralités
WW
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
NOTE 2 II est recommandé d’utiliser cette technique
I’ISO 7218.
lorsque le nombre c.herché est supposé se trouver dans
l’intervalle de 1 à 100 par millilitre ou par gramme d’échan-
tillon pour essai.
5.2 Diluant
Ensemencement de trois tubes de milieu double
concentration avec une quantité déterminee de
Voir I’ISO 6887 et la norme spécifique traitant du
l’échantillon pour essai si le produit à examiner est li-
produit à analyser.
quide, ou avec une quantité determinee de suspen-
sion mére dans le cas d’autres produits.
Ensemencement de trois tubes de milieu simple
concentration avec une quantité determinée de
5.3 Milieux de culture
l’echantillon pour essai si le produit à examiner est li-
quide, ou avec une quantité determinée de suspen-
sion mère dans le cas d’autres produits, puis, dans les
53.1 Milieu tamponné, à la bile, au vert brillant
mêmes conditions, ensemencement de trois tubes
et au glucose (milieu E.E.)
de milieu simple concentration avec la première dilu-
tion decimale obtenue à partir de l’échantillon pour
essai ou de la suspension mère.
5.3.1 .l Composition
Incubation des tubes à 35 “C ou 37 “C (selon accord)
pendant 24 h.
a) b)
Milieu simple
Milieu double
À partir du nombre de tubes confirmes positifs, calcul
concentration concentration
du nombre le plus probable d’Enterobacteriaceae par
millilitre ou par gramme d’échantillon pour essai au
Peptone 20,o g lao g
moyen de la table NPP (voir annexe A).
Glucose lOtO g 5,o g
Hydrogénophosphate
disodique (Na,HPO,) 12,90 g
645 g
Dihydrogénophosphate
4.2.2 Comptage des colonies
de potassium KH2P0,)
4,o g zo g
NOTE 3 II est recommandé d’utiliser cette technique Bile de boeuf
déshydratée
lorsque le nombre cherché est supposé supérieur à 100 par 40 g mo g
millilitre ou par gramme d’échantillon pour essai.
Vert brillant 0,030 g 0,015 g
Eau 1 000 ml 1 000 ml
Ensemencement en profondeur du milieu gélosé à la
bile, au cristal violet et au glucose, coule dans deux
boîtes de Petri, avec une quantité determinée de
l’échantillon pour essai si le produit à examiner est li-
5.3.1.2 Préparation
quide, ou avec une quantité determinée de la sus-
pension mère dans le cas d’autres produits.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
Recouvrement avec une couche du même milieu.
hydrate dans l’eau, en portant le tout à Abullition. Ne
pas chauffer le milieu plus de 30 min. Refroidir le mi-
Dans les mêmes conditions, ensemencement d’au-
lieu rapidement.
tres paires de boîtes avec les dilutions decimales ob-
tenues a partir de l’echantillon pour essai ou de la
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après ébulli-
suspension mère.
tion, il soit de 7,2 à 25 “C.
Incubation des boîtes à 35 “C ou 37 “C (selon accord)
Repartir le milieu de culture par quantités de 10 ml
pendant 24 h & 2 h.
dans des tubes stériles (6.8).
À partir du nombre de colonies caractéristiques
Ne pas stériliser le milieu a l’autoclave.
confirmées par boîte de Petri, calcul du nombre
d’Enterobacteriaceae par millilitre ou par gramme Le milieu peut être conserve 1 semaine au maximum
d’échantillon pour essai.
entre 0 OC et 5 OC.
2
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ISO 7402:1993(F)
Gélose à la bile, au cristal violet et au 5.3.3 Gélose glucosée
5.3.2
glucose (VRBG)
5.3.3.1 Composition
5.3.2.1 Composition
Tryptone
lO,O g
Extrait de levure 1’5 g
Glucose
IW g
Peptone
7’0 g
Chlorure de sodium 5’0 g
Extrait de levure
3’0 g
Pourpre de bromocrésol 0,015 g
Sels biliaires
1’5 g
Agar-agar 8g à18g')
Glucose
lao g
1 000 ml
Eau
Chlorure de sodium
5’0 g
Rouge neutre
0’03 g
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Cristal violet 0,002 g
Agar-agar, en poudre ou en flocons 8à18g’)
Eau 1 000 ml
5.3.3.2 PrBparation
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
hydrate dans l’eau, en chauffant si necessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
sation, il soit de 7,0 à 25 OC.
5.3.2.2 Préparation
Repartir le milieu de culture par quantités de 15 ml
dans des tubes (6.8).
Dissoudre les composants ou le milieu complet des-
hydrate dans l’eau, en portant le tout à ebullition. Ne
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglée à 121 “C pendant
pas chauffer le milieu plus de 30 min.
15 min.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après ébulli-
Maintenir les tubes en position verticale.
tion, il soit de 7,4 à 25 “C.
Le milieu peut être conserve 1 semaine au maximum
entre 0 OC et 5 OC.
Repartir le milieu de culture dans des tubes stériles
ou dans des flacons steriles (6.5) de 500 ml de capa-
Juste avant l’emploi, chauffer dans de l’eau bouillante
cite maximale.
ou sous courant de vapeur pendant 15 min, puis re-
froidir rapidement à la température d’incubation.
Ne pas steriliser le milieu a l’autoclave.
Préparer ce milieu extemporanément (voir 9.2.2 et
5.3.4 Gelose nutritive
9.3.1).
5.3.4.1 Composition
5.3.2.3 Prdparation des boîtes de gelose
Extrait de viande de boeuf
(seulement nécessaire pour la technique NPP - voir 3’0 4
9.2.2)
54 g
Peptone
8a18g’)
Agar-agar, en poudre ou flocons
Transférer immediatement environ 15 ml du milieu de
Eau 1 000 ml
culture, refroidi à environ 45 OC, dans des boîtes de
Petri (6.3) et laisser se solidifier.
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Juste avant l’emploi, secher les boîtes de gélose, de
préférence avec le couvercle enleve et la surface de
la gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3)
5.3.4.2 Préparation
jusqu’à séchage de la surface de la gélose.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
Si elles ont été préparées à l’avance, les boîtes de
hydrate dans l’eau, en chauffant si necessaire.
gélose non sechées ne doivent pas être conservees
plus de 4 h à la température ambiante ou plus d’un Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
jour entre 0 “C et 5 OC. sation, il soit de 7,0 a 25 “C.
---------------------- Page: 7 ----------------------
Réparti r le milieu de c ulture dans ou des 6.4 pH-mètre, précis à rt: 0,l unité pH à 25 “C.
des tubes
flacons (6.8) de 500 ml de capacité maximale.
6.5 Bain d’eau, ou dispositif similaire, réglable à
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglée à 121 “C durant
45 “C + 1 "C.
-
15 min.
6.6 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plasti-
5.3.4.3 Préparation des boîtes de gélose (voir
que, de diametre 90 mm a 100 mm.
9.4.1)
Transférer immédiatement environ 15 ml du milieu de
6.7 Anse bouclée, d’un diamètre d’environ 3 mm,
culture, puis refroidir à environ 45 “C, dans des boîtes
et fil droit en platine iridié ou en nickel-chrome, ou
de Petri (6.6) et laisser se solidifier.
baguette de verre ou anse bouclée à usage unique.
Juste avant l’emploi, sécher les boîtes de gélose, de
NOTE 5 Le nickel-chrome ne convient pas pour l’essai à
préférence avec le couvercle enlevé et la surface de
l’oxydase (voir 9.4.2.1).
la gélose tournee vers le bas, dans une etuve (6.3)
jusqu’à séchage de la surface de la gélose.
dimensions
6.8 Tubes à essai, de
Si elles ont été préparées à l’avance, les boîtes de
16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm environ, et
gélose non séchées ne doivent pas être conservées
flacons ou fioles, de capacité comprise entre 150 ml
plus de 4 h à la température ambiante ou plus d’un
et 500 ml.
jour entre 0 “C et 5 “C.
6.9 Pipettes graduées à écoulement total, de ca-
5.4 Réactif pour l’essai à l’oxydase pacités nominales de 1 ml et 10 ml, graduées res-
pectivement en 0,l ml et 0,5 ml.
5.4.1 Composition
7 Échantillonnage
Dichlorhydrate de N,N,N’,N’ -
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
tétraméthyl-p-phénylène diamine
1’0 g
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
Eau 100 ml
modifié lors du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
spécifiée dans la présente Norme internationale. S’il
5.4.2 Préparation
n’existe pas de Norme internationale spécifique à
l’échantillonnage du produit concerné, il est recom-
Dissoudre le réactif dans l’eau froide.
mandé que les parties concernées se mettent d’ac-
cord à ce sujet.
Préparer le réactif immédiatement avant usage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6 Appareillage et verrerie
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
NOTE 4 Le matériel à usage unique est acceptable au
Norme internationale spécifique du produit concerné.
même titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
sont similaires.
il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et
notamment:
9 Mode opératoire
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche
(four) ou en chaleur humide (autoclave)
9.1 Prise d’essai, suspension
...
Questions, Comments and Discussion
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