ISO 846:1997
(Main)Plastics — Evaluation of the action of microorganisms
Plastics — Evaluation of the action of microorganisms
Plastiques — Évaluation de l'action des micro-organismes
La présente Norme internationale prescrit des méthodes pour la détermination de la détérioration des plastiques lorsqu'ils sont exposés à l'action des champignons et des bactéries, et à celle des micro-organismes vivant dans le sol. Elle n'a pas pour but de déterminer la biodégradabilité des plastiques. Le type et l'ampleur de la détérioration engendrée peuvent être déterminés a) par un examen visuel et/ou b) à partir des variations de masse et/ou c) à partir des variations d'autres propriétés physiques. Les essais sont applicables à tous les produits fabriqués en matériaux plastiques ayant une surface plane et qui peuvent, de ce fait, être aisément nettoyés, exception faite de matériaux poreux, tels les mousses en matériaux plastiques. La présente Norme internationale utilise les mêmes champignons pour essai que la CEI 68-2-10. La méthode CEI, qui utilise ce qu'on appelle des «spécimens assemblés», nécessite l'inoculation des éprouvettes avec une suspension de spores, l'incubation des éprouvettes inoc 352ulées et l'estimation de la croissance fongique ainsi que de l'attaque physique des éprouvettes. Le volume des essais et les souches d'essai à utiliser dépendront de l'application prévue pour le plastique. De ce fait, il convient de définir avant les essais les paramètres utilisés et de les consigner dans le rapport d'essai.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
IS0
INTERNATIONAL
846
STANDARD
Second edition
1997006- 15
Evaluation of the action
Plastics -
of microorganisms
Plastiques - haha tion de /‘action des micro-organismes
Reference number
IS0 846:1997(E)
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IS0 846: 1997(E)
Page
Contents
iv
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
Introduction
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 Scope
2
................................................................
2 Normative references
2
..................................................................................
3 Definitions
2
Principle .
4
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5 Apparatus and materials
7
Test specimens .
6
8
..........................................................
7 Preparation of specimens
9
Procedures .
8
14
...............................................................................
9 Assessment
16
Expression of results .
10
17
.................................................
11 Accuracy of the measurements
17
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12 Test report
18
..~............................................................................
13 Bibliography
Annexes
A Determination of the water content and water-holding capacity
19
of a soil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
B Precision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C Information on test fungi
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii
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Q IS0 IS0 846: 1997(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 846 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 61, Plastics, Subcommittee SC 6, Ageing, chemical and environ-
mental resistance.
This second edition cancels and replaces the first edition (IS0 846:1978),
which has been technically revised.
The Plastics Project Group of the IBRG (International Biodeterioration
Research Group) carried out several interlaboratory tests between 1984
and 1990, using the 1978 edition of this standard, with the aim of checking
the reproducibility of the test results. The experience gained from these
tests has been incorporated in the present edition. In addition, a soil-burial
test method has been included in subclause 8.5, based on a specification
the Eidgenossische Materialprijfungsanstalt in St. Gallen, Switzerland.
Annex A forms an integral part of this International Standard. Annexes B
and C are for information only.
. . .
III
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IS0 846: 1997(E)
Introduction
Under certain climatic and environmental conditions, microorganisms may
settle on and colonize the surface of plastics or plastics products. Their
presence and/or their metabolic products may not only damage the plastic
itself, but may also affect the serviceability of building materials and
systems containing plastic parts.
The tests and test condit :ions l specif #ied in this lnternationa ,I Standard are
empirical and cover most- but not all- poten tial applications.
For specific applications and for long -term tests, procedures
agreed upon which reflect performance under actual conditions.
The actions of microorganisms on plastics are influenced by two different
processes:
a) direct action: the deterioration of plastics which serve as a nutritive
substance for the growth of the microorganisms;
indirect action: the influence of metabolic products of the micro-
b)
or fu rther deterioration.
organisms, e.g. discolouration
This International Standard deals with both of these two processes, as well
as their combined action.
iv
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-
IS0 846:1997( E)
INTERNATIONAL STANDARD 0 Iso
Plastics - Evaluation of the action of microorganisms
WARNING - Handling and manipulation of microorganisms which are potentially hazardous requires
a high degree of technical competence and may be subject to current national legislation and regulations.
Only personnel trained in microbiological techniques should carry out such tests. Codes of practice for
disinfection, sterilization and personal hygiene must be strictly observed.
It is recommended that workers consult IEC 6812110:1988, appendix A “Danger to personnel”, and
General rules for microbiological
IS0 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs -
examinations.
1 Scope
This International Standard specifies methods for determining the deterioration of plastics due to the action
of fungi and bacteria and soil microorganisms. The aim is not to determine the biodegradability of plastics.
The type and extent of deterioration may be determined by
a) visual examination
and/or
b) changes in mass
and/or
changes in other physical properties.
C)
The tests are applicable to all articles made of plastic that have an even surface and that can thus be easily
cleaned. The exceptions are porous materials, such as plastic foams.
This International Standard uses the same test fungi as IEC 68-2- 10. The IEC method, which uses so-called
“assembled specimens”, calls for inoculation of the specimens with a spore suspension, incubation of the inoculated
specimens and assessment of the fungal growth as well as any physical attack on the specimens.
The volume of testing and the test strains used will depend on the application envisaged for the plastic. These
parameters should therefore be agreed upon before the tests and should be stated in the test report.
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2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and IS0 maintain
registers of currently valid International Standards.
IS0 291 :-I), Plasfics - Standard atmospheres for conditioning and testing.
IEC 68 -2 - IO: 1988, Basic environmental testing procedures - Par? 2: Tests - Test J and guidance: Mould growth.
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the following definitions apply:
3.1 biodeterioration: A change in the chemical or physical properties of a material due to the action of a
microorganism.
3.2 fungistatic effect: The antimycotic effect of an antimicrobial treatment which prevents a given material from
being overgrown by fungi under moist conditions.
3.3 biodegradation: The term “biodegradation” is being discussed by TC 61/SC 5/W/G 22, Biodegradability, and
the official definition will be included here when it is available.
4 Principle
4.1 The test involves exposing test specimens of plastic to the action of selected test strains of fungi and bacteria
(or, in the case of the soil-burial test, to microbially active soil) for specified or agreed periods of time under
specified conditions of temperature and humidity.
At the end of the exposure, the test specimens are assessed before and/or after clean ing by visual examination
r other physical properties is determined.
and/or change in mass o
any
(batch I) are compared with
The results obtained with the specimens exposed to biological attack those obtained
from untreated specimens (batch 0) or sterile specimens (batch S) kept under the sa ,me conditions.
4.2 Short descriptions of the test methods used to determine the resistance of plastics to fungi (method A)
or the fungistatic effects (methods B and B’), resistance to bacteria (method C) and resistance to soil
microorganisms (method D) are given below.
4.2.1 Resistance to fungi
4.2.1.1 Method A: Fungal-growth test
Test specimens are exposed to a mixed suspension of fungus spores in the presence of an incomplete nutritive
medium (without a carbon source). The fungi can only grow at the expense of the material. If the specimens contain
no nutritive component, the fungi cannot develop mycelia and there is no deterioration of the plastic.
1) To be published. (Revision of IS0 291:1977)
2
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Method A is suitable for the assessment of the inherent resistance of plastics to fungal attack in the absence of
other organic matter.
It is recommended that, when method A is carried out, methods B and B’ are also carried out to assist in the
interpretation of the results.
4.2.1.2 Methods B and B’: Determination of fungistatic effects
Test specimens are exposed to a mixed suspension of fungus spores in the presence of a complete medium,
i.e. with a carbon source. Even if the plastic does not contain any nutritive elements, the fungi can grow over the
specimens and their metabolic products can attack the material.
Any inhibition of the growth either on the plastic or in the growth medium (zone of inhibition) shows fungistatic
activity of the plastic or the presence of a fungicidal treatment.
In method B’, the specimens are not placed on the nutritive medium until it is completely overgrown.
Methods B and B’ are used when surface contamination is expected. In order to save time, and for a better
understanding of the phenomenon, it is recommended that the two methods are carried out simultaneously.
4.2.2 Method C: Resistance to bacteria
The action of bacteria on test specimens is assessed using a n incomplete medium. If there is no g rowth in the agar
round the specimen, then the specimen does not contain any nutritive components.
4.2.3 Method D: Resistance to microbially active soil (soil-burial test)
Test specimens are completely buried in natural soil with a known water-holding capacity and a specified moisture
content (see annex A).
The soil-burial test has been included in this International Standard because many plastics are used in permanent
contact with soil and exposed to high humidities.
4.3 Choice of properties for assessment of biodeterioration
The choice of the properties to be determined depends on the aim of the test. A visual assessme nt of biological
attack should preferably always be made as the first stage in assessing the resistance of the plastic.
The measurement of changes in mass is recommended, especially for those plastics that contain biologically
degradable substances, such as plasticizers, lubricants and stabilizers (as in plasticized PVC, for instance). The
measured loss is, in this case, often lower than the actual loss as the biologically degradable substance is only
partly utilized and the metabolic products often remain in the plastic.
When, above a .II, the surface is affected, it is recommended that determinations be made of those properties which
clearly indicate surface changes, such as surface gloss, flexural properties, impa ct resistance and hardness.
5 Apparatus and materials
5.1 For all tests
5.1 .l Incubators
That used for tests involving fungal and bacterial attack shall be capable of controlling the temperature to -t-j OC
at any temperature from 20 “C to 35 “C at a relative humidity of 90 % or greater.
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That used for soil-burial tests shall be capable of controlling the temperature to f 1 “C at 29 “C at a relative humidity
of 95% or greater.
NOTE - Experience has shown that it is preferable to use two incubators: one for Petri dish tests and another for soil-burial
tests.
5.1.2 Oven, capable of controlling the temperature at 45 “C for drying test specimens and at between 103 “C and
105 “C for determining the water-holding capacity of soil.
5.1.3 Desiccator, capable of maintaining standard temperature and humidity conditions (23 OC and 50 % R.H.)
for the conditioning of test and control specimens.
51.4 Autoclave, capable of maintaining a temperature and pressure of 120 “C and 2 bar, respectively, for
sterilizing Petri dishes and soil.
5.1.5 Analytical balance, accurate to 0,l mg.
5.1.6 Laboratory centrifuge.
5.1.7 Stereoscopic microscope, magnification x 50.
5.1.8 Glass or plastic disposable Petri dishes, of suitable size for exposing test specimens.
5.1.9 Glass containers, with a volume of about 1 litre (height 16 cm; diameter 11 cm), for example preserving jars
with covers.
5.1 .lO Distilled or deionized water.
The water used for the preparation of all solutions and nutritive media and for all determinations shall be distilled
or deionized and have a conductivity of < 1 @/cm.
5.1 .ll Microbicidal solutions:
5.1.11.1 Ethanol-water mixture, in the proportions, by mass, of 70:30.
5.1 .11.2 o-Phenylphenol.
Dissolve 1 g of ephenylphenol in 50 ml of 90 % ethanol, make up to 1 000 ml with water and adjust the pH to 3,s by
adding lactic acid drop by drop.
The microbicidal solution used shall be stated in the test report.
5.2 For tests with fungi
5.2.1 Test fungi.
The test fungi shall be obtained from national culture collections The strains to be used are listed in table 1, and be
stated in the test report.
4
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Table 1
Name
Strain
Aspergillus niger van Tieghem
ATCC 6275
Penicillium funiculosum Thorn CMI 114933
Paecilomyces variotii Bainier
ATCC 18502
Gliocladium virens Miller et al. ATCC 9645
Chaetomium globosum Kunze: Fries
ATCC 6205
If there are technical reasons, and by agreement between the interested parties, other species may be used. In this
case, too, the strains used shall be stated in the test report.
When carrying out tests on plastics intended for use in electronic components and electronic equipment, using the
method specified in IEC 68 -2 - 10, use Aspergihs niger, Penicilium funicu/osum, Paecilomyces variotii and
Gliocladium virens from table 1 and the four strains given in table 2.
Table 2
Name Strain
Aspergillus terreus Thorn QM 82j
Aureobasidium pullulans (de Bar-y) Arnaud ATCC 9348
Penicillium ochrochloron Biourge ATCC 9112
Scopulariopsis brevicaulis (Saccardo) Bainier CMI 49528
5.2.2 Stock strains.
Culture the test fungi (5.2.1) in tubes on agar slants of the following composition:
Oatmeal
20 g
Malt extract
IQ
Agar
20 g
Water 1 000 ml
Sterilize at 120 “C + 1 “C for 20 min in an autoclave in an atmosphere saturated with water vapour.
After incubation at 29 OC + 1 OC or 24 “C + 1 “C, well sporulating cultures may then be used. They shall not be
stored for more than 4 weeks at this temperature.
Because of the possibility of genetic and physiological changes in the test fungi during culturing on artificial media,
the intervals between subculturing shall be reduced to a minimum by suitable measures (e.g. lyophilization
of cultures, storage at + 4 “C or in liquid nitrogen).
5
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5.2.3 Solutions and nutritive media:
5.2.3.1 Stock mineral-salt solution, of the following composition (use only chemicals of analytical grade or
equivalent purity):
NaNOs 290 g
KH2P04 097 g
K2HP04 093 g
KCI 095 g
MgS04*7H20
0’5 g
FeS04-7H20
WI g
H20 1 000 ml
Adjust the pH to 6,0 to 6,5 with sterile 0,Ol mol/l NaOH solution.
5.2.3.2 Mineral-salt/wetting-agent solution, prepared by adding to 1 litre of stock mineral-salt solution (5.2.3.1)
0,l g of a non-toxic wetting agent such as IV-methyltaurine or polyglycol ether and sterilizing in an autoclave at
120 “C + 1 “C for 20 min.
5.2.3.3 Mineral-salt/glucose solution, prepared by adding to stock mineral-salt solution (5.2.3.1) sufficient
glucose to give a concentration of 30 g/l + 1 g/l and sterilizing in an autoclave at 115 “C + 1 “C for 30 min.
5.2.3.4 Incomplete agar medium, prepared by adding to stock mineral-salt solution (5.2.3.1) sufficient agar to
give a concentration of 20 g/l. Dissolve the agar by boiling the solution whilst stirring. Sterilize in an autoclave at
120 “C + 1 “C for 20 min. Adjust the pH to 6,0 to 6,5 with sterile 0,Ol mol/l NaOH solution.
5.2.3.5 Complete agar medium, prepared by adding to the incomplete agar medium (5.2.3.4) sufficient glucose to
give a concentration of 30 g/l rt 1 g/l. Sterilize in an autoclave at 115 “C + 1 “C for 30 min. After sterilization, adjust
the pH to between 6,0 and 6,5 at 20 “C with sterile 0,Ol mol/l NaOH solution.
5.3 For tests with bacteria
5.3.1 Test bacterium Pseudomonas aeruginosa, strain NCTC 8060 or ATCC 13388.
A well-defined strain of the test bacterium shall be obtained from a national culture collection. Cultivate the test
strain on brain-heart infusion agar (5.3.2.1).
If, by agreement, additional test bacteria are used, they shall be mentioned in the test report.
5.3.2 Nutritive media and solutions
5.3.2.1 Brain-heart infusion agar.
Casein soybean peptone agar may be used as an alternative.
The medium may be obtained from commercial suppliers and shall be prepared in accordance with the
manufacturer’s instructions
6
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5.3.2.2 Brain-heart infusion broth.
Casein soybean peptone broth may be used as an alternative.
The medium may be obtained from commercial suppliers and shall be prepared in accordance with the
manufacturer’s instructions.
5.3.2.3 Mineral-salt agar, prepared by making up a solution of the following composition:
KH2P04
097 g
K2HP04
017 g
MgS04*7H20
0’7 9
NH4N03
llg
0,005 g
NaCI
FeS04=7H20 0,002 g
0,002 g
ZnS04=7H20
MnS0407H20 0,001 g
1 000 ml
H20
and adding 20 g of agar to the solution. Sterilize in an autoclave at 120 “C + 1 “C for 20 min. Adjust the pH to 7,0
at 20 “C with 0,Ol mol/l NaOH solution.
5.3.2.4 Sterile buffer solution, pH 7,0 at 20 “C.
Prepare the following two solutions separately:
9,l g/l (solution A)
KH2P04
Na2HP04 II,9 g/l (solution B)
Mix 600 ml of solution A with 400 ml of solution B. Sterilize in an autoclave at 120 OC k 1 OC for 20 min. Adjust the
pH to 7,0 at 20 “C by adding 0,Ol mol/l NaOH solution.
5.4 For soil-burial tests
Use an activated soil with a moisture content of (60 + 5) % of the water-holding capacity of the soil (see annex A).
The water-holding capacity is the water content of a soil when it is saturated with water.
The pH of an aqueous soil extract (1 g of soil in 20 g of water) shall be between 4,0 and 7,0.
Determine the moisture content and water-holding capacity of the soil in accordance with annex A. If the moisture
content of the soil exceeds the above figure, spread it out in a thin layer under ambient laboratory conditions. Do not
heat the soil or allow it to dry out as this may affect the soil microflora. If the moisture content needs to be raised,
use an aqueous solution of 1 g of ammonium nitrate and 0,2 g of dipotassium phosphate in 1 litre of water.
6 Test specimens
6.1 Shape and dimensions
The shape and dimensions of the specimens will depend on any tests to be carried out following exposure to the
fungi, bacteria or soil.
7
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If it is necessary to measure changes in the thickness of the specimens, use specimens taken from the original
material. If the material is to be moulded before use, use specimens of maximum thickness 05 mm.
If changes in mass are to be measured, use square specimens of side 30 mm to 60 mm with a maximum thickness
of 2 mm. When visual examination is used to assess changes in appearance, specimen dimensions are not as
critical. However, a thickness of 05 mm to 2 mm is recommended.
Since the microorganisms may attack the surface of the plastic tested, only results using specimens of the same
dimensions may be compared.
6.2 Specimen batches and numbers in each batch
6.2.1 Specimen batches
For each sample and each test method, prepare three batches of specimens:
batch 0: control specimens, stored under standard temperature and moisture conditions;
batch I: specimens inoculated with microorganisms and incubated;
batch S: sterile specimens, stored under the same conditions as batch I.
6.2.2 Numbers in each batch
For visual examination, prepare at least five specimens for each batch, i.e. a total of at least 15 specimens per
sample and per test method.
For determination of mass changes, prepare at least six specimens for each batch, i.e. a total of at least
18 specimens per sample and per test method.
For other assessment procedures, use the number of specimens specified in the referring standard.
The test procedure for each assessment shall be carried out separately.
in
However, specime ns for determining changes mass or other physical properties also be used for visual
may
examination.
7 Preparation of specimens
7.1 Cleaning
Dip specimens for methods A and C into an ethanol-water mixture (5.1 .I 1 .I) for 1 min and dry at 45 “C for 4 h,
unless they are adversely affected by ethanol. In the latter case, store the specimens in a sterile container, handling
them with sterile forceps. Carry out all subsequent handling of the specimens using forceps to avoid contamination
by extraneous organic matter.
Do not clean specimens for methods B, B’ or D.
7.2 Labelling and storage
Store the cleaned and labelled (or marked) specimens in Petri dishes (5.1.8) at ambient temperature.
Labelling or marking may result in surface reactions by the plastic during the test. In such cases, store the
specimens separately in suitable containers (e.g. Petri dishes) and mark the Petri dishes, not the specimens, to
avoid surface reactions In all other cases, the specimens may be labelled directly using a suitable marker.
8
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7.3 Conditioning and weighing
Store batches of specimens used for determining change in mass at ambient temperature in a desiccator (5.1.3)
until the mass of each specimen (ml, 1-122, ma, etc.) is constant to the nearest 0,l mg (usually after 48 h). Record the
mass of each specimen. Unless otherwise agreed, specimens for visual examination and/or for determination of
changes in physical properties other than mass do not need conditioning at this stage.
It may be agreed between the interested parties to store the specimens in a desiccator (5.1.3) at 45 “C. In this case,
cool over silica gel to room temperature before use and store until constant mass is reached at 20 “C + 1 “C and
(65 + 3) % R.H. If this procedure is followed, it shall be mentioned in the test report.
8 Procedures
8.1 Test temperature
Prepare and assess specimens at standard conditions (see IS0 291) of 23 “C k 1 “C and (50 + 3) % R.H.; incubate
themat24”Ckl “Cor29”Cfl OC.
8.2 Test methods
A general scheme of the test methods described is shown in table 3.
The choice of method and of the properties to be measured depends on the material under test and the conditions
of use envisaged to it.
Table 3 - Summary of test methods
Tests Tests
Tests with fungi
with bacteria with soil
Method A B B’ C D
8.2.2 8.2.2.7 8.2.3 8.2.4
Subclause 8.2.1
Mineral-salt agar
incomplete agar Complete agar Complete agar (5.3.2.3)
Soil
medium medium None medium inoculated as
Medium used
(see 5.4)
(5.2.3.5) (5.2.3.5) specified in
(5.2.3.4)
8.2.3.5
Batch I S I S I I S I S I S
Solution
sprayed on sp-s MS-S sp-s MS-S sp-s sp-s MS-S None MS-S None MS-S
specimenl)
24”CH “Cor29”Cfl “C 29 “C + 1 “C
Incubation
conditions
4 weeks or more; > 95 % relative humidity*)
1) Sp-S = spore suspension; MS-S = microbicidal solution.
2) This humidity is reached by the agar medium in methods A, B, B’ and C. For method D, the incubator shall have
a controlled relative humidity of at least 95 %.
9
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8.2.1 Fungal-growth test (method A)
8.2.1.1 Filling the Petri dishes
After sterilization, pour incomplete agar medium (5.2.3.4) into sterile Petri dishes to give a depth of about 5 mm.
It solidifies on cooling.
8.2.1.2 Arrangement of test specimens
Place the specimens separately, as flat as possible, on the solidified medium, avoiding any contact between
specimens or with the walls of the Petri dishes. Divide the prepared Petri dishes randomly into two equal batches,
one labelled I, the other S.
If it is anticipated that the specimens may lift away from the medium, ballast them with weights.
8.2.1.3 Preparation of spore suspension
Produce a spore suspension from well sporulated cultures, using mineral-salt/wetting-agent solution (5.2.3.2),
as follows:
8.2.1.3.1 Harvesting the spores
Introduce into each culture tube (see 5.2.2) 5 ml of mineral-salt/wetting agent solution. Gently scrape the surface of
the sporulating culture with a sterile inoculation needle to obtain an aqueous suspension of the spores. Gently
shake the culture tube to disperse the spores in the liquid. Repeat this procedure with the same culture tube three
times. Then shake the spore suspension of each fungal culture with sterile glass beads and filter through a thin
layer of sterile cotton or glass wool to remove mycelial fragments.
8.2.1.3.2 Washing the spores by centrifugation, and preparation of working suspensions
Aseptically centrifuge the filtered spore suspension and discard the supernatant liquid. Re-suspend the residue in
25 ml of mineral-salt solution (5.2.3.1) and centrifuge again. Suspend the washed residue in 50 ml of stock mineral-
salt solution. This repeated washing of the spore suspensions is intended to guarantee that all surface-active
substances are removed which might cause stress cracking in some plastics.
Adjust the concentration to about 106 spores/ml (determined using a counting chamber or by turbimetry).
Repeat these operations with each test fungus. Blend equal volumes of five suspensions containing the same
number of spores to obtain the final mixed spore suspension ready for inoculation. Use the spore suspension within
6 h of preparation.
NOTE - When new plastics formulations are tested, the investigator may wish to carry out preliminary tests using individual
fungi or selected combinations of fungi.
8.2.1.4 Spore viability check
Fill two sterile Petri dishes with complete agar medium (5.2.3.5), following the procedure given in 8.2.1 .I and
inoculate with one drop of each of the spore suspensions (before blending the spore suspension). Incubate
at 24 “C + 1 “C or 29 “C + 1 “C for 3 to 4 days (carry out the variability check at the same temperature as the actual
determination). In the absence of copious growth, prepare a new spore suspension from other culture tubes and
repeat the test.
8.2.1.5 Inoculation or disinfection of specimens
For each specimen in batch I, spray or pipette evenly on to the surface of the specimen and of the agar 0,l ml of the
spore suspension prepared in 8.2.1.3. For each specimen in batch S, pipette 3 ml of microbicidal solution (5.1 .I 1)
on to the surface.
10
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@ IS0
IS0 846:1997(E)
8.2.1.6 Incubation
Incubate both the inoculated specimens and the sterile controls either at 24 OC + 1 OC or at 29 OC & 1 OC for
4 weeks, or longer by agreement between the interested parties. Take precautions to prevent condensed water
dropping onto the surface of the specimens. If the test lasts more than 4 weeks, re-inoculate the speci
...
NORME ISO
846
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1997-06- 15
Évaluation de l’action
Plastiques -
des micro-organismes
- Evaluation of fhe action of microorganisms
Plastics
Numéro de référence
ISO 846: 1997(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 846: 1997(F)
Page
Sommaire
iv
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Introduction
............................................................... 1
1 Domaine d’application
2
..............................................................
2 Références normatives
2
3 Définitions .
2
......................................................................................
4 Principe
.......................................................... 4
5 Appareillage et matériaux
............................................................................... 8
6 Éprouvettes
9
7 Préparation des éprouvettes .
..................................................................... 9
8 Modes opératoires
15
Estimation .
9
........................................................... 16
10 Expression des résultats
18
........................................................
11 Exactitude des mesurages
.......................................................................... 18
12 Rapport d’essai
19
..............................................................................
13 Bibliographie
Annexes
A Détermination de la teneur en eau et de la capacité de
20
rétention d’eau d’un sol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
B Fidélité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
pour essai . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
relatives aux champignons
C Informations
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Case postale 56
Internet central @ isoch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
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ISO 846:1997(F)
@ ISO
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La norme internationale ISO 846 a été élaborée par le comité technique
ISOTTC 61, Plastiques, sous-comité SC 6, VieWssemenf et résistance aux
agents chimiques et environnants.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 846:1978), dont elle constitue une révision technique.
Le Groupe des Projets Plastiques de l’International Biodeterioration
Research Group (Groupe international de recherche sur la biodé-
térioration) a effectué plusieurs essais interlaboratoires entre 1984 et 1990
en appliquant la méthodologie préconisée dans l’édition de 1978 de cette
norme, dans le but de contrôler la reproductibilité des résultats d’essai.
L’expérience acquise lors de ces essais a été incorporée dans la présente
édition. En outre, un essai par enfouissement dans le sol a été ajouté dans
le paragraphe 8.2.4, fondé sur une spécification établie par la Eidgenos-
sische Materialprüfungsanstalt de Saint-Gall, en Suisse.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internation ale. Les
onnées uniquement à titre
annexes B et C sont d d’information.
. . .
Ill
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ISO 846: 1997(F) @ ISO
Introduction
Dans certaines conditions climatiques et environnementales, les micro-
organismes peuvent se fixer et coloniser la surface des plastiques ou des
produits en matériaux plastiques. Non seulement leur présence effou les
produits de leur métabolisme peuvent endommager le plastique lui-même,
mais il arrive qu’ils altèrent également l’aptitude à l’emploi des matériaux de
construction et des systèmes qui comprennent des parties en matériaux
plastiques.
Les essais et les conditions d’essai prescrites dans la présente Norme
internationale sont empiriques et couvrent beaucoup d’applications
possibles, mais pas toutes.
Pour certaines applications spécifiques et pour certains essais de longue
durée, il convient de se mettre d’accord sur des modes opératoires qui
reflètent les performances dans les conditions réelles.
L’action des micro-organismes sur les plastiques est influencée par deux
types de processus:
a) action directe: détérioration du plastique qui sert de substance nutritive
pour la croissance des micro-organismes;
b) action indirecte: influence des produits du métabolisme des micro-
organismes, par exemple: décoloration ou aggravation de la détério-
ration.
La présente Norme internationale traite de ces deux processus et de leur
action combinée.
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NORME INTERNATIONALE @ Iso ISO 846: 1997(F)
Plastiques - Évaluation de l’action des micro-organismes
AVERTISSEMENT - La manutention et la manipulation de micro-organismes potentiellement dangereux,
requièrent un niveau élevé de compétences techniques et peuvent être soumises aux réglementations
et à la législation nationales en vigueur. II convient que ces essais ne soient effectués que par un
personnel spécialement formé aux techniques de microbiologie. Les codes de bonnes pratiques de
désinfection, de stérilisation et d’hygiène doivent être rigoureusement respectées.
II est recommandé aux opérateurs de consulter la CEI 68-2-10:1988, annexe A intitulée ((Dangers pour
le personnel>>, ainsi que I’ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens
microbiologiques.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit des méthodes pour la détermination de la détérioration des plastiques
lorsqu’ils sont exposés à l’action des champignons et des bactéries, et à celle des micro-organismes vivant dans le
sol. Elle n’a pas pour but de déterminer la biodégradabilité des plastiques.
Le type et l’ampleur de la détérioration engendrée peuvent être déterminés
a) par un examen visuel
et/ou
b) à partir des variations de masse
et/ou
à partir des variations d’autres propriétés physiques.
C)
Les essais sont applicables à tous les produits fabriqués en matériaux plastiques ayant une surface plane et qui
peuvent, de ce fait, être aisément nettoyés, exception faite de matériaux poreux, tels les mousses en matériaux
plastiques.
La présente Norme internationale utilise les mêmes champignons pour essai que la CEI 68-2-10. La méthode CEI,
qui utilise ce qu’on appelle des >, nécessite l’inoculation des éprouvettes avec une
suspension de spores, l’incubation des éprouvettes inoculées et l’estimation de la croissance fongique ainsi que de
l’attaque physique des éprouvettes.
Le volume des essais et les souches d’essai à utiliser dépendront de l’application prévue pour le plastique. De ce
fait, il convient de définir avant les essais les paramètres utilisés et de les consigner dans le rapport d’essai.
1
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0 ISO
ISO 846:1997(F)
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette a révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées a rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
- Atmosphères normales de conditionnement et d’essai.
ISO 291: -1), Plastiques
CEI 68-2 - 10:1988, Essais fondamentaux climatiques et de robustesse mécanique - Partie 2: Essais - Essai J
et guide: Moisissures.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s’appliquent:
3.1 biodétérioration: Variation des propriétés chimiques ou physiques d’un matériau provoquée par l’action d’un
micro-organisme.
3.2 effet fongistatique: Effet antimycotique d’un traitement antimicrobien qui empêche un matériau donné de se
recouvrir de champignons dans des conditions d’humidité.
3.3 biodégradation: Le terme ttbiodégradation >> fait l’objet de discussions au sein du TC 61/SC 5M/G 22,
Biodégradabilitté, et la définition officielle sera ajoutée ici une fois disponible.
4 Principe
4.1 L’essai consiste à exposer des éprouvettes de plastique à l’action de souches déterminées de champignons et
de bactéries (ou, dans le cadre de l’essai par enfouissement dans le sol, à l’action d’un sol microbiologiquement
actif) pendant des durées spécifiées ou ayant fait l’objet d’un accord entre les parties intéressées, et dans des
conditions déterminées de température et d’humidité.
À la fin de l’exposition, les éprouvettes font l’objet d’une estimation avant et/ou après nettoyage, par examen visuel
et/ou en déterminant les variations de masse ou d’autres propriétés physiques.
Les résultats obtenus avec les éprouvettes exposées à l’attaque biologique (lot 1) sont comparés à ceux obtenus
avec des éprouvettes non traitées (lot 0) ou avec des éprouvettes stériles (lot S) conservées dans des conditions
identiques.
4.2 La description succincte des méthodes d’essai utilisées pour déterminer la résistance des plastiques aux
champignons (méthode A) ou les effets fongistatiques (méthodes B et B’), la résistance aux bactéries (méthode C)
et la résistance aux micro-organismes contenus dans le sol (méthode D) est donnée ci-après.
4.2.1 Résistance aux champignons
4.2.1 .l Méthode A: Essai de croissance fongique
Les éprouvettes sont exposées à une suspension de plusieurs spores de champign ons en présence d’un milieu
carbone). Les champignons ne peuvent croître
nutri tif incomplet (exempt de sou rce de qu’au détriment du matériau.
1) À publier. (Révision de US0 291:1977)
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@ ISO
ISO 846: 1997(F)
Si les éprouvettes ne contiennent aucune substance nutritive, les champignons ne peuvent développer le mycélium
et il n’y a pas détérioration du plastique.
La méthode A est appropriée à l’estimation de la résistance inhérente des plastiques à toute attaque fongique en
l’absence de toute autre matière organique.
Il est recommandé que, en mettant en œuvre Pa méthode A, Oes méthodes B et B’ soient également mises en œuvre
en vue de faciliter l’interprétation des résultats.
4.2.1.2 Méthodes B et B’: Détermination des effets fongistatiques
Les éprouvettes sont exposées à une suspension de plusieurs spores de champignons en présence d’un milieu
nutritif complet (c’est-à-dire, avec une source de carbone). Même si le plastique ne contient aucune substance
nutritive, les champignons peuvent se développer sur les éprouvettes et les produits de leur métabolisme peuvent
attaquer le matériau.
Toute inhibition de la croissance sur le plastique ou dans le milieu nutritif (zone d’inhibition) met en évidence
l’activité fongistatique du plastique ou la présence d’un traitement fongicide.
Dans la méthode B’, les éprouvettes ne sont pas mises sur je milieu nutritif tant qu’il n’est pas Complètement
couvert.
Les méthodes B et B’ sont utilisées lorsqu’une contamination de la surface est prévisible.
Pour ne pas perdre de temps et pour garantir une meilleure compréhension du phénomène, il est recommandé de
mettre en œuvre les deux méthodes simultanément.
4.2.2 Méthode C: Résistance aux bactéries
L’estimation de l’action des bactéries sur les éprouvettes s’effectue en utilisant un milieu incomplet. Si l’on ne
constate aucune croissance dans I’agar-agar autour de l’éprouvette, cette dernière ne contient pas de substances
nutritives.
4.2.3 Méthode D: Résistance à un sol microbiologiquement actif (essai par enfouissement dans le sol)
ies da ns un sol naturel caractérisé
Les éprou vettes sont complètement enfou par une capacité de rétention d’eau
connue et par une teneur en eau spécifiée (voir a nnexe .
A)
L’essai par enfouis se men t dans le sol a été inclus dans la présente Norm e internationale car un grand no mbre
de
plastiques sont utili sé 1s en contact permanen t avec le sol et exposésàdes ni veaux élevés d’hu midité.
4.3 Choix des propriétés pour l’évaluation de la biodétérioration
Le choix des propriétés à déterminer dépend du but de l’essai. II convient de toujours procéder à une estimation
visuelle de l’attaque biologique; celui-ci tiendra lieu de première étape dans l’estimation de la résistance du
plastique.
II est recommandé de mesurer les variations de masse, en particulier pour les plastiques qui contiennent des
substances biologiquement dégradables, tels que Oes plastifiants, lubrifiants et stabilisants (comme, par exemple,
dans le PVC plastifié). Dans ce cas, la perte de masse mesurée est souvent inférieure à la perte de masse réelle
puisque la substance biologiquement dégradable n’est que partiellement utilisée et que les produits métaboliques
subsistent fréquemment dans le plastique.
Lorsque la modification porte, avant tout, sur la surface, il est recommandé de déterminer les propriétés qui
indiquent de manière nette les variations de l’état de surface, telles que brillant de surface, propriétés en flexion,
résistance au choc et dureté.
3
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ISO 846: 1997(F)
5 Appareillage et matériaux
Pour tous les essais
5.1
5.1 .l Incubateurs.
Ils sont utilisés pour effectuer des essais sur des souches fongiques et bactériennes; ils doivent permettre de
maintenir le réglage de la température à &-1 “C, et d’établir une température de 20 “C à 35 “C à une humidité
relative d’au moins 90 %.
Ils sont également utilisés pour effectuer des essais par enfouissement dans le sol; ils doivent permettre de
maintenir le réglage de la température à +l “C et d’établir une température de 29 “C à une humidité relative d’au
moins 95%.
NOTE - L’expérience à montré qu ‘il est préférable d’utiliser deux incubateu rs: l’un pour les essais effectués avec les boîtes
de Petri et l’autre pour les essais par enfouissement dans le sol.
51.2 Étuve, permettant de maintenir la température à 45 “C pour sécher les éprouvettes, et une température
comprise entre 103 “C et 105°C pour déterminer la capacité de rétention d’eau du sol.
51.3 Dessiccateur, permettant de maintenir les conditions normales de température et d’humidité (23 “C et 50 %
d’humidité relative), pour conditionner les éprouvettes et les témoins,
51.4 Autoclave, permettant de maintenir une température de 120 “C et une pression de 2 bar, pour stériliser les
boîtes de Petri et le sol.
5.1.5 Balance analytique, précise à 0,l mg.
5.1.6 Centrifugeuse de laboratoire.
5.1.7 Microscope stéréoscopique, permettant d’obtenir un grossissement de x 50.
5.1.8 Boîtes de Petri jetables, en verre ou en plastique, de dimensions appropriées pour exposer les éprouvettes.
5.1.9 Récipients en verre, d’une capacité d’environ 1 litre (16 cm de hauteur et II cm de diamètre), tels que les
pots à confiture avec leur couvercle.
5.1 .lO Eau distillée ou déionisée.
I
soluti ons et les milieux nutritifs et celle employée pour les déterminations doit être
Le au utilisée po ur préparer les
de l’eau distillée ou déionisé le et avoir une conductivité < 1 @/cm.
5.1 .ll Solutions microbicides
5.1.11.1 Mélange eau-éthanol, en proportions, en masse, de 70:30.
5.1 .11.2 o-Phénylphénol.
Dissoudre 1 g de o-phénylphénol dans 50 ml d’éthanol à 90 %, compléter à 1 000 ml avec de l’eau et ajuster le pH
à 3,5 par addition, goutte à goutte, d’acide lactique.
La solution microbicide utilisée doit être consignée dans le rapport d’essai.
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ISO 846: 1997(F)
5.2 Pour les essais avec les champignons
5.2.1 Champignons pour essai.
Les champignons pour essai doivent être obtenus auprès des collections nationales de cultures. Les souches à
utiliser sont énumérées dans le tableau 1 et consignées dans le rapport d’essai.
Tableau 1
Nom Souche
Aspergîlius niger van Tieghem ATCC 6275
Penicillium funiculosum Thom
CMI 114933
Paecilomyces variotii Bainier ATCC 18502
G/ioc!adium virens Miller et a/.
ATCC 9645
Chaetomium globosum Kunze: Frics ATCC 6205
Pour certaines raisons techniques et conformément à tout accord éventuellement conclu entre les parties
intéressées, il est possible d’utiliser d’autres espèces. En tout état de cause, les espèces utilisées doivent être
consignées dans le rapport d’essai.
Si les essais doivent être conduits sur des plastiques destinés à être utilisés dans la fabrication d’appareils et de
composants électroniques conformément à la méthode prescrite dans la CEI 68-2-10, utiliser les champignons
Aspergillus niger, Penicillium funiculosum, Paecilomyces variotii et Gliocladium virens, pris dans le tableau 1,
conjointement aux quatre souches mentionnées dans le tableau 2.
Tableau 2
~~~
Nom
Souche
I
Aspergillus terreus Thom QM 82j
Aureobasidium pululans (de Baty) Arnaud ATCC 9348
Penicillium ochrochloron Biourge
ATCC 9112
Scopulariopsis brevicaulis (Saccardo) Bainier CMI 49528
5.2.2 Souches mères.
Cultiver les champignons pour essai (5.2.1) dans des tubes à essai sur de la gélose oblique, ayant la composition
suivante:
Farine d’avoine
20 g
Extrait de malt
w
Agar-agar
20 cl
Eau 1 000 ml
Stériliser à 120 “C + 1 “C pendant 20 min dans un autoclave en atmosphère saturée de vapeur d’eau.
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ISO 846: 1997(F)
Après incubation à 29 “C + 1 “C ou 24 “C + 1 OC, les cultures abondamment sporulées peuvent alors être utilisées.
Elles ne doivent pas être conservées plus de quatre semaines à cette température.
Étant donné que les champignons pour essai peuvent subir des modifications génétiques et physiologiques
pendant la mise en culture sur les milieux artificiels, il faut réduire au maximum les intervalles entre chaque
préparation de sous-cultures par des mesures appropriées (par exemple lyophilisation des cultures, conservation
à + 4 “C ou dans de l’azote liquide).
5.2.3 Solutions et milieux nutritifs
5.2.3.1 Solution mère de sels minéraux, ayant la composition suivante (utiliser uniquement des produits
chimiques de qualité analytique reconnue ou de pureté équivalente):
NaNOs
2’0 g
KH2P04
097 g
K2HP04
03 g
KCI
095 g
MgS04,7H20
0’5 g
FeS04,7H20
WI g
1 000 ml
H20
Ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.2.3.2 Solution de sels minéraux/agent mouillant, préparée en ajoutant, à 1 litre de solution mère de sels
minéraux (5.2.3.1), 0,l g d’agent mouillant non toxique tel que la A/-méthyltaurine ou le polyglycol éther, et en
stérilisant en autoclave à 120 “C + 1 “C pendant 20 min.
5.2.3.3 Solution de sels minéraux/glucose, préparée en ajoutant à la solution mère de sels minéraux (5.2.3.1)
suffisamment de glucose pour obtenir une concentration de 30 g/l + 1 g/l et en stérilisant en autoclave à
115 OC + 1 OC pendant 30 min.
5.2.3.4 Milieu gélosé incomplet, préparé en ajoutant à la solution mère de sels minéraux (5.2.3.1) suffisamment
d’agar-agar pour obtenir une concentration de 20 g/l. Mettre I’agar-agar en solution en portant la solution à ébullition
sous agitation. Stériliser en autoclave à 120 “C + 1 “C pendant 20 min. Après stérilisation, ajuster le pH entre 6,0
et 6,5 avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.2.3.5 Milieu gélosé complet, préparé en ajoutant au milieu gélosé incomplet (5.2.3.3) suffisamment de glucose
pour obtenir une concentration de 30 g/l + 1 g/l, et en stérilisant en autoclave à 115 “C + 1 “C pendant 30 min.
Après stérilisation, ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 à 20 “C avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
avec bactéries
5.3 Pour les essais
5.3.1 Bactérie pour essai, constituée d’une souche de Pseudomonas aeruginosa NCTC 8060 ou
ATCC 13388.
On doit se procurer une souche bien définie de bactérie pour essai auprès d’une collection nationale de cultures.
Cultiver la souche sur de I’agar-agar aux extraits de cerveau et de cœur (voir 5.3.2.1).
Si l’on s’accorde pour utiliser d’autres bactéries, on doit les consigner dans le rapport d’essai.
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@ ISO ISO 846:1997(F)
5.3.2 Milieux nutritifs et solutions
5.3.2.1 Agar-agar aux extraits de cerveau et de cœur.
.
En variante, on peut utiliser de I’agar-agar à base de caséine de soja peptone.
Le milieu peut être obtenu auprès de fournisseurs et doit avoir été préparé conformément aux instructions du
fabricant.
5.3.2.2 Bouillon aux extraits de cerveau et de cœur.
En variante, on peut utiliser un bouillon à base de caséine de soja peptone.
Le milieu peut être obtenu auprès de fournisseurs et doit avoir été préparé conformément aux instructions du
fabricant.
5.3.2.3 Milieu gélosé aux sels minéraux, préparé en réalisant une solution ayant la composition suivante:
KH2P04
097 g
K2HP04 037 g
MgS04,7H20 097 g
NH4N03
Ig
0,005 g
NaCI
FeS04,7H20 0,002 g
ZnS04,7H20 0,002 g
MnS04,7H20 0,001 g
1 000 ml
H20
et en ajoutant 20 g d’agar-agar à la solution. Stériliser en autoclave à 120 “C rt 1 “C pendant 20 min. Ajuster le pH
à 7,0 à 20 OC avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.3.2.4 Solution tampon stérile, pH 7,0 à 20 OC.
Préparer séparément les deux solutions suivantes:
KH2P04 9,l g/l (solution A)
Na2HP04 Il,9 g/l (solution B)
Mélanger 600 ml de solution A avec 400 ml de solution B. Stériliser en autoclave à 120 “C rfr 1 OC pendant 20 min.
Ajuster le pH à 7,0 à 20 “C avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.4 Pour les essais par enfouissement dans le sol
Utiliser un sol activé ayant une teneur en eau de (60 If: 5) % de la capacité de rétention d’eau du sol (voir annexe A).
La capacité de rétention d’eau est la teneur en eau d’un sol lorsqu’il est saturé d’eau.
Le pH d’un extrait aqueux de sol (1 g de sol dans 20 g d’eau) doit être compris entre 4,0 et 7,0.
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@ ISO
ISO 846: 1997(F)
Déterminer la teneur en eau et la capacité de rétention d’eau du sol conformément à l’annexe A. Si la teneur en
eaux du sol dépasse la valeur susmentionnée, étaler le sol en mince couche dans les conditions ambiantes de
laboratoire. Ne pas chauffer ni laisser sécher le sol car cette opération est susceptible d’altérer la microflore qu’il
contient. Si la teneur en eau doit être augmentée, utiliser une solution aqueuse composée de 1 g de nitrate
d’ammonium et de 0,2 g de phosphate dipotassique par litre d’eau.
6 Éprouvettes
6.1 Forme et dimensions
La forme et les dimensions d es éprouvettes dépendron t des essais devant être effectués après l’exposition aux
champignon s ou bactéries, ou après enfouissement dans le sol.
S’il est nécessaire de déterminer les variations de l’épaisseur des éprouvettes, utiliser des éprouvettes provenant
du matériau original. Si le matériau doit être moulé avant utilisation’ utiliser des éprouvettes de 0,5 mm d’épaisseur
maximale.
S’il est nécessaire de déterminer les variations de masse, utiliser des éprouvettes carrées de 30 mm à 60 mm de
côté et 2 mm d’épaisseur maximale. Lorsqu’on procède à un examen visuel pour estimer les modifications d’aspect,
les dimensions des éprouvettes ne sont pas aussi critiques. Cependant, une épaisseur de 0,5 mm à 2 mm est
recommandée.
Les micro-organismes pouvant attaquer la surface du plastique essayé, seuls les résultats ayant été obtenus à
partir d’éprouvettes de dimensions identiques peuvent être comparés.
62 . Lots d’éprouvettes et nombres dans chaque lot
6.2.1 Lots d’éprouvettes
Préparer trois lots d’éprouvettes par échantillon et par méthode d’essai:
lot 0: éprouvettes témoins, conservées dans les conditions normales de température et d’humidité;
lot 1: éprouvettes ensemencées avec des micro-organismes et incubées;
lot S: éprouvettes stériles, conservées dans les mêmes conditions que celles du lot 1.
6.2.2 Nombre dans chaque lot
visuel, préparer au moins cinq éprouvettes de chaque lot, c’est-à-dire un total d’au moins
Pour l’examen
15 éprouvettes par échantillon et méthode d’essai.
Par
Pour la d étermi nation des variations de masse, préparer au moins six éprouvettes de chaque lot, c’est-à-dire un
rouvettes par échantillon et par méthode d’essai.
total d’au moins 18ép
Pour les autres méthodes d’estimation, utiliser le nombre d’éprouvettes prescrit dans la norme appropriée.
les éprouvettes utilisées pour déterminer les
Effectuer séparément les différentes estimations. Néanmoins,
variations de masse ou d’autres propriétés physiques peuvent également être utilisées pour effectuer l’examen
visuel.
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0 ISO
ISO 846: 1997(F)
7 Préparation des éprouvettes
.
7.1 Nettoyage
Pour les méthodes A et C, plonger les éprouvettes pendant 1 min dans du mélange eau-éthanol (5.1 .l 1 .l ) et les
sécher à 45 “C pendant 4 h, à moins qu’elles ne soient endommagées par I’éthanol. Dans ce dernier cas, conserver
les éprouvettes dans un récipient stérile, en les manipulant avec des brucelles stériles. Effectuer toutes les
manipulations auxquelles les éprouvettes seront ultérieurement soumises en utilisant des brucelles pour éviter toute
contamination organique extérieure.
Ne pas nettoyer les éprouvettes pour les méthodes B, B’ ou D.
7.2 Étiquetage et stockage
Une fois nettoyées et étiquetées munies d’un marquage), conserver les éprouvettes
dans des boîtes de Pet ri
(5.1.8) à la température ambiante
L’étiquetage et le marquage peuvent provoquer des réactions superficielles par le plastique pendant l’essai. Si c’est
le cas, conserver les éprouvettes séparément dans des récipients appropriés (par exemple boîtes de Petri) et
marquer les récipients, non les éprouvettes, afin d’éviter toute réaction superficielle. Dans tous les autres cas, les
éprouvettes peuvent être étiquetées directement à condition d’utiliser un marqueur approprié.
7.3 Conditionnement et pesée
Conserver les lots d’éprouvettes utilisés pour déterminer Oes variations de masse à la température ambiante dans le
dessiccateur (5.1 03) jusqu’à ce que la masse de chaque éprouvette (IIZ~, m2, ma, etc.) soit constante à 0,l mg près
(c’est généralement le cas au bout de 48 h). Noter la masse de chaque éprouvette. Sauf accord contraire, les
éprouvettes utilisées pour l’examen visuel et/ou pour déterminer les variations de propriétés physiques autres que
la masse (5.1.3) ne nécessitent aucun conditionnement à ce stade.
Les parties intéressées peuvent convenir de conserver les éprouvettes dans le dessiccateur (5.1.3) à 45 OC. Dans
ce cas, les refroidir au-dessus d’un gel de silice jusqu’à la température ambiante avant emploi et les conserver
jusqu’à l’obtention d’une masse constante à 20 “C t 1 “C et à (65 + 3) % d’humidité relative. Si ce mode opératoire
est suivi, cela doit être consigné dans le rapport d’essai.
8 Modes opératoires
8.1 Températures d’essai
Préparer et estimer les éprouvettes dans les conditions normales (voir ISO 291) de 23 OC + 1 OC avec une humidité
relative de (50 k 3) %; les incuber à 24 “C + 1 “C ou 29 “6 + 1 “C.
8.2 Méthodes d’essai
Le tableau 3 donne une présentation générale des méthodes d’essai décrites.
Le choix de la méthode et des propriétés à mesurer dépend du matériau soumis à l’essai et des conditions pour
l’emploi prévu.
9
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ISO 846: 1997(F) 0 ISO
Tableau 3 - Présentation générale des méthodes d’essai
Essais par
Essais
Essais avec champignons
enfouissement
avec bactéries
dans le sol
conformément à
Lot d’éprouvettes I S I I I
S S I S l S
Solution pulvérisée
SP-S MS-S SP-S MS-S SP-S
SP-S MS-S Aucune MS-S Aucune MS-S
sur les éprouvettesl)
24 “C I!I 1 “C ou 29 “C + 1 “C 29 “C I!I 1 “C
Conditions
\ I
d’incubation
Au moins 4 semaines;
> 95 % d’humidité relative*)
I
1) SP-S = suspension de spores;
MS-S = solution microbicide.
I
2) Cette humidité est atteinte par le milieu gélosé avec les méthodes A, B, B’ et C. Pour la méthode D, l’incubateur doit
avoir une humidité relative contrôlée d’au moins 95 %.
I I
8.2.1 Essai de croissance des champignons (méthode A)
8.2.1 .l Garnissage des boî
...
NORME ISO
846
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1997-06- 15
Évaluation de l’action
Plastiques -
des micro-organismes
- Evaluation of fhe action of microorganisms
Plastics
Numéro de référence
ISO 846: 1997(F)
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ISO 846: 1997(F)
Page
Sommaire
iv
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Introduction
............................................................... 1
1 Domaine d’application
2
..............................................................
2 Références normatives
2
3 Définitions .
2
......................................................................................
4 Principe
.......................................................... 4
5 Appareillage et matériaux
............................................................................... 8
6 Éprouvettes
9
7 Préparation des éprouvettes .
..................................................................... 9
8 Modes opératoires
15
Estimation .
9
........................................................... 16
10 Expression des résultats
18
........................................................
11 Exactitude des mesurages
.......................................................................... 18
12 Rapport d’essai
19
..............................................................................
13 Bibliographie
Annexes
A Détermination de la teneur en eau et de la capacité de
20
rétention d’eau d’un sol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
B Fidélité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
pour essai . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
relatives aux champignons
C Informations
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Case postale 56
Internet central @ isoch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
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ISO 846:1997(F)
@ ISO
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La norme internationale ISO 846 a été élaborée par le comité technique
ISOTTC 61, Plastiques, sous-comité SC 6, VieWssemenf et résistance aux
agents chimiques et environnants.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 846:1978), dont elle constitue une révision technique.
Le Groupe des Projets Plastiques de l’International Biodeterioration
Research Group (Groupe international de recherche sur la biodé-
térioration) a effectué plusieurs essais interlaboratoires entre 1984 et 1990
en appliquant la méthodologie préconisée dans l’édition de 1978 de cette
norme, dans le but de contrôler la reproductibilité des résultats d’essai.
L’expérience acquise lors de ces essais a été incorporée dans la présente
édition. En outre, un essai par enfouissement dans le sol a été ajouté dans
le paragraphe 8.2.4, fondé sur une spécification établie par la Eidgenos-
sische Materialprüfungsanstalt de Saint-Gall, en Suisse.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internation ale. Les
onnées uniquement à titre
annexes B et C sont d d’information.
. . .
Ill
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ISO 846: 1997(F) @ ISO
Introduction
Dans certaines conditions climatiques et environnementales, les micro-
organismes peuvent se fixer et coloniser la surface des plastiques ou des
produits en matériaux plastiques. Non seulement leur présence effou les
produits de leur métabolisme peuvent endommager le plastique lui-même,
mais il arrive qu’ils altèrent également l’aptitude à l’emploi des matériaux de
construction et des systèmes qui comprennent des parties en matériaux
plastiques.
Les essais et les conditions d’essai prescrites dans la présente Norme
internationale sont empiriques et couvrent beaucoup d’applications
possibles, mais pas toutes.
Pour certaines applications spécifiques et pour certains essais de longue
durée, il convient de se mettre d’accord sur des modes opératoires qui
reflètent les performances dans les conditions réelles.
L’action des micro-organismes sur les plastiques est influencée par deux
types de processus:
a) action directe: détérioration du plastique qui sert de substance nutritive
pour la croissance des micro-organismes;
b) action indirecte: influence des produits du métabolisme des micro-
organismes, par exemple: décoloration ou aggravation de la détério-
ration.
La présente Norme internationale traite de ces deux processus et de leur
action combinée.
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NORME INTERNATIONALE @ Iso ISO 846: 1997(F)
Plastiques - Évaluation de l’action des micro-organismes
AVERTISSEMENT - La manutention et la manipulation de micro-organismes potentiellement dangereux,
requièrent un niveau élevé de compétences techniques et peuvent être soumises aux réglementations
et à la législation nationales en vigueur. II convient que ces essais ne soient effectués que par un
personnel spécialement formé aux techniques de microbiologie. Les codes de bonnes pratiques de
désinfection, de stérilisation et d’hygiène doivent être rigoureusement respectées.
II est recommandé aux opérateurs de consulter la CEI 68-2-10:1988, annexe A intitulée ((Dangers pour
le personnel>>, ainsi que I’ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens
microbiologiques.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit des méthodes pour la détermination de la détérioration des plastiques
lorsqu’ils sont exposés à l’action des champignons et des bactéries, et à celle des micro-organismes vivant dans le
sol. Elle n’a pas pour but de déterminer la biodégradabilité des plastiques.
Le type et l’ampleur de la détérioration engendrée peuvent être déterminés
a) par un examen visuel
et/ou
b) à partir des variations de masse
et/ou
à partir des variations d’autres propriétés physiques.
C)
Les essais sont applicables à tous les produits fabriqués en matériaux plastiques ayant une surface plane et qui
peuvent, de ce fait, être aisément nettoyés, exception faite de matériaux poreux, tels les mousses en matériaux
plastiques.
La présente Norme internationale utilise les mêmes champignons pour essai que la CEI 68-2-10. La méthode CEI,
qui utilise ce qu’on appelle des >, nécessite l’inoculation des éprouvettes avec une
suspension de spores, l’incubation des éprouvettes inoculées et l’estimation de la croissance fongique ainsi que de
l’attaque physique des éprouvettes.
Le volume des essais et les souches d’essai à utiliser dépendront de l’application prévue pour le plastique. De ce
fait, il convient de définir avant les essais les paramètres utilisés et de les consigner dans le rapport d’essai.
1
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0 ISO
ISO 846:1997(F)
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette a révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées a rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
- Atmosphères normales de conditionnement et d’essai.
ISO 291: -1), Plastiques
CEI 68-2 - 10:1988, Essais fondamentaux climatiques et de robustesse mécanique - Partie 2: Essais - Essai J
et guide: Moisissures.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s’appliquent:
3.1 biodétérioration: Variation des propriétés chimiques ou physiques d’un matériau provoquée par l’action d’un
micro-organisme.
3.2 effet fongistatique: Effet antimycotique d’un traitement antimicrobien qui empêche un matériau donné de se
recouvrir de champignons dans des conditions d’humidité.
3.3 biodégradation: Le terme ttbiodégradation >> fait l’objet de discussions au sein du TC 61/SC 5M/G 22,
Biodégradabilitté, et la définition officielle sera ajoutée ici une fois disponible.
4 Principe
4.1 L’essai consiste à exposer des éprouvettes de plastique à l’action de souches déterminées de champignons et
de bactéries (ou, dans le cadre de l’essai par enfouissement dans le sol, à l’action d’un sol microbiologiquement
actif) pendant des durées spécifiées ou ayant fait l’objet d’un accord entre les parties intéressées, et dans des
conditions déterminées de température et d’humidité.
À la fin de l’exposition, les éprouvettes font l’objet d’une estimation avant et/ou après nettoyage, par examen visuel
et/ou en déterminant les variations de masse ou d’autres propriétés physiques.
Les résultats obtenus avec les éprouvettes exposées à l’attaque biologique (lot 1) sont comparés à ceux obtenus
avec des éprouvettes non traitées (lot 0) ou avec des éprouvettes stériles (lot S) conservées dans des conditions
identiques.
4.2 La description succincte des méthodes d’essai utilisées pour déterminer la résistance des plastiques aux
champignons (méthode A) ou les effets fongistatiques (méthodes B et B’), la résistance aux bactéries (méthode C)
et la résistance aux micro-organismes contenus dans le sol (méthode D) est donnée ci-après.
4.2.1 Résistance aux champignons
4.2.1 .l Méthode A: Essai de croissance fongique
Les éprouvettes sont exposées à une suspension de plusieurs spores de champign ons en présence d’un milieu
carbone). Les champignons ne peuvent croître
nutri tif incomplet (exempt de sou rce de qu’au détriment du matériau.
1) À publier. (Révision de US0 291:1977)
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ISO 846: 1997(F)
Si les éprouvettes ne contiennent aucune substance nutritive, les champignons ne peuvent développer le mycélium
et il n’y a pas détérioration du plastique.
La méthode A est appropriée à l’estimation de la résistance inhérente des plastiques à toute attaque fongique en
l’absence de toute autre matière organique.
Il est recommandé que, en mettant en œuvre Pa méthode A, Oes méthodes B et B’ soient également mises en œuvre
en vue de faciliter l’interprétation des résultats.
4.2.1.2 Méthodes B et B’: Détermination des effets fongistatiques
Les éprouvettes sont exposées à une suspension de plusieurs spores de champignons en présence d’un milieu
nutritif complet (c’est-à-dire, avec une source de carbone). Même si le plastique ne contient aucune substance
nutritive, les champignons peuvent se développer sur les éprouvettes et les produits de leur métabolisme peuvent
attaquer le matériau.
Toute inhibition de la croissance sur le plastique ou dans le milieu nutritif (zone d’inhibition) met en évidence
l’activité fongistatique du plastique ou la présence d’un traitement fongicide.
Dans la méthode B’, les éprouvettes ne sont pas mises sur je milieu nutritif tant qu’il n’est pas Complètement
couvert.
Les méthodes B et B’ sont utilisées lorsqu’une contamination de la surface est prévisible.
Pour ne pas perdre de temps et pour garantir une meilleure compréhension du phénomène, il est recommandé de
mettre en œuvre les deux méthodes simultanément.
4.2.2 Méthode C: Résistance aux bactéries
L’estimation de l’action des bactéries sur les éprouvettes s’effectue en utilisant un milieu incomplet. Si l’on ne
constate aucune croissance dans I’agar-agar autour de l’éprouvette, cette dernière ne contient pas de substances
nutritives.
4.2.3 Méthode D: Résistance à un sol microbiologiquement actif (essai par enfouissement dans le sol)
ies da ns un sol naturel caractérisé
Les éprou vettes sont complètement enfou par une capacité de rétention d’eau
connue et par une teneur en eau spécifiée (voir a nnexe .
A)
L’essai par enfouis se men t dans le sol a été inclus dans la présente Norm e internationale car un grand no mbre
de
plastiques sont utili sé 1s en contact permanen t avec le sol et exposésàdes ni veaux élevés d’hu midité.
4.3 Choix des propriétés pour l’évaluation de la biodétérioration
Le choix des propriétés à déterminer dépend du but de l’essai. II convient de toujours procéder à une estimation
visuelle de l’attaque biologique; celui-ci tiendra lieu de première étape dans l’estimation de la résistance du
plastique.
II est recommandé de mesurer les variations de masse, en particulier pour les plastiques qui contiennent des
substances biologiquement dégradables, tels que Oes plastifiants, lubrifiants et stabilisants (comme, par exemple,
dans le PVC plastifié). Dans ce cas, la perte de masse mesurée est souvent inférieure à la perte de masse réelle
puisque la substance biologiquement dégradable n’est que partiellement utilisée et que les produits métaboliques
subsistent fréquemment dans le plastique.
Lorsque la modification porte, avant tout, sur la surface, il est recommandé de déterminer les propriétés qui
indiquent de manière nette les variations de l’état de surface, telles que brillant de surface, propriétés en flexion,
résistance au choc et dureté.
3
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5 Appareillage et matériaux
Pour tous les essais
5.1
5.1 .l Incubateurs.
Ils sont utilisés pour effectuer des essais sur des souches fongiques et bactériennes; ils doivent permettre de
maintenir le réglage de la température à &-1 “C, et d’établir une température de 20 “C à 35 “C à une humidité
relative d’au moins 90 %.
Ils sont également utilisés pour effectuer des essais par enfouissement dans le sol; ils doivent permettre de
maintenir le réglage de la température à +l “C et d’établir une température de 29 “C à une humidité relative d’au
moins 95%.
NOTE - L’expérience à montré qu ‘il est préférable d’utiliser deux incubateu rs: l’un pour les essais effectués avec les boîtes
de Petri et l’autre pour les essais par enfouissement dans le sol.
51.2 Étuve, permettant de maintenir la température à 45 “C pour sécher les éprouvettes, et une température
comprise entre 103 “C et 105°C pour déterminer la capacité de rétention d’eau du sol.
51.3 Dessiccateur, permettant de maintenir les conditions normales de température et d’humidité (23 “C et 50 %
d’humidité relative), pour conditionner les éprouvettes et les témoins,
51.4 Autoclave, permettant de maintenir une température de 120 “C et une pression de 2 bar, pour stériliser les
boîtes de Petri et le sol.
5.1.5 Balance analytique, précise à 0,l mg.
5.1.6 Centrifugeuse de laboratoire.
5.1.7 Microscope stéréoscopique, permettant d’obtenir un grossissement de x 50.
5.1.8 Boîtes de Petri jetables, en verre ou en plastique, de dimensions appropriées pour exposer les éprouvettes.
5.1.9 Récipients en verre, d’une capacité d’environ 1 litre (16 cm de hauteur et II cm de diamètre), tels que les
pots à confiture avec leur couvercle.
5.1 .lO Eau distillée ou déionisée.
I
soluti ons et les milieux nutritifs et celle employée pour les déterminations doit être
Le au utilisée po ur préparer les
de l’eau distillée ou déionisé le et avoir une conductivité < 1 @/cm.
5.1 .ll Solutions microbicides
5.1.11.1 Mélange eau-éthanol, en proportions, en masse, de 70:30.
5.1 .11.2 o-Phénylphénol.
Dissoudre 1 g de o-phénylphénol dans 50 ml d’éthanol à 90 %, compléter à 1 000 ml avec de l’eau et ajuster le pH
à 3,5 par addition, goutte à goutte, d’acide lactique.
La solution microbicide utilisée doit être consignée dans le rapport d’essai.
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ISO 846: 1997(F)
5.2 Pour les essais avec les champignons
5.2.1 Champignons pour essai.
Les champignons pour essai doivent être obtenus auprès des collections nationales de cultures. Les souches à
utiliser sont énumérées dans le tableau 1 et consignées dans le rapport d’essai.
Tableau 1
Nom Souche
Aspergîlius niger van Tieghem ATCC 6275
Penicillium funiculosum Thom
CMI 114933
Paecilomyces variotii Bainier ATCC 18502
G/ioc!adium virens Miller et a/.
ATCC 9645
Chaetomium globosum Kunze: Frics ATCC 6205
Pour certaines raisons techniques et conformément à tout accord éventuellement conclu entre les parties
intéressées, il est possible d’utiliser d’autres espèces. En tout état de cause, les espèces utilisées doivent être
consignées dans le rapport d’essai.
Si les essais doivent être conduits sur des plastiques destinés à être utilisés dans la fabrication d’appareils et de
composants électroniques conformément à la méthode prescrite dans la CEI 68-2-10, utiliser les champignons
Aspergillus niger, Penicillium funiculosum, Paecilomyces variotii et Gliocladium virens, pris dans le tableau 1,
conjointement aux quatre souches mentionnées dans le tableau 2.
Tableau 2
~~~
Nom
Souche
I
Aspergillus terreus Thom QM 82j
Aureobasidium pululans (de Baty) Arnaud ATCC 9348
Penicillium ochrochloron Biourge
ATCC 9112
Scopulariopsis brevicaulis (Saccardo) Bainier CMI 49528
5.2.2 Souches mères.
Cultiver les champignons pour essai (5.2.1) dans des tubes à essai sur de la gélose oblique, ayant la composition
suivante:
Farine d’avoine
20 g
Extrait de malt
w
Agar-agar
20 cl
Eau 1 000 ml
Stériliser à 120 “C + 1 “C pendant 20 min dans un autoclave en atmosphère saturée de vapeur d’eau.
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ISO 846: 1997(F)
Après incubation à 29 “C + 1 “C ou 24 “C + 1 OC, les cultures abondamment sporulées peuvent alors être utilisées.
Elles ne doivent pas être conservées plus de quatre semaines à cette température.
Étant donné que les champignons pour essai peuvent subir des modifications génétiques et physiologiques
pendant la mise en culture sur les milieux artificiels, il faut réduire au maximum les intervalles entre chaque
préparation de sous-cultures par des mesures appropriées (par exemple lyophilisation des cultures, conservation
à + 4 “C ou dans de l’azote liquide).
5.2.3 Solutions et milieux nutritifs
5.2.3.1 Solution mère de sels minéraux, ayant la composition suivante (utiliser uniquement des produits
chimiques de qualité analytique reconnue ou de pureté équivalente):
NaNOs
2’0 g
KH2P04
097 g
K2HP04
03 g
KCI
095 g
MgS04,7H20
0’5 g
FeS04,7H20
WI g
1 000 ml
H20
Ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.2.3.2 Solution de sels minéraux/agent mouillant, préparée en ajoutant, à 1 litre de solution mère de sels
minéraux (5.2.3.1), 0,l g d’agent mouillant non toxique tel que la A/-méthyltaurine ou le polyglycol éther, et en
stérilisant en autoclave à 120 “C + 1 “C pendant 20 min.
5.2.3.3 Solution de sels minéraux/glucose, préparée en ajoutant à la solution mère de sels minéraux (5.2.3.1)
suffisamment de glucose pour obtenir une concentration de 30 g/l + 1 g/l et en stérilisant en autoclave à
115 OC + 1 OC pendant 30 min.
5.2.3.4 Milieu gélosé incomplet, préparé en ajoutant à la solution mère de sels minéraux (5.2.3.1) suffisamment
d’agar-agar pour obtenir une concentration de 20 g/l. Mettre I’agar-agar en solution en portant la solution à ébullition
sous agitation. Stériliser en autoclave à 120 “C + 1 “C pendant 20 min. Après stérilisation, ajuster le pH entre 6,0
et 6,5 avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.2.3.5 Milieu gélosé complet, préparé en ajoutant au milieu gélosé incomplet (5.2.3.3) suffisamment de glucose
pour obtenir une concentration de 30 g/l + 1 g/l, et en stérilisant en autoclave à 115 “C + 1 “C pendant 30 min.
Après stérilisation, ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 à 20 “C avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
avec bactéries
5.3 Pour les essais
5.3.1 Bactérie pour essai, constituée d’une souche de Pseudomonas aeruginosa NCTC 8060 ou
ATCC 13388.
On doit se procurer une souche bien définie de bactérie pour essai auprès d’une collection nationale de cultures.
Cultiver la souche sur de I’agar-agar aux extraits de cerveau et de cœur (voir 5.3.2.1).
Si l’on s’accorde pour utiliser d’autres bactéries, on doit les consigner dans le rapport d’essai.
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@ ISO ISO 846:1997(F)
5.3.2 Milieux nutritifs et solutions
5.3.2.1 Agar-agar aux extraits de cerveau et de cœur.
.
En variante, on peut utiliser de I’agar-agar à base de caséine de soja peptone.
Le milieu peut être obtenu auprès de fournisseurs et doit avoir été préparé conformément aux instructions du
fabricant.
5.3.2.2 Bouillon aux extraits de cerveau et de cœur.
En variante, on peut utiliser un bouillon à base de caséine de soja peptone.
Le milieu peut être obtenu auprès de fournisseurs et doit avoir été préparé conformément aux instructions du
fabricant.
5.3.2.3 Milieu gélosé aux sels minéraux, préparé en réalisant une solution ayant la composition suivante:
KH2P04
097 g
K2HP04 037 g
MgS04,7H20 097 g
NH4N03
Ig
0,005 g
NaCI
FeS04,7H20 0,002 g
ZnS04,7H20 0,002 g
MnS04,7H20 0,001 g
1 000 ml
H20
et en ajoutant 20 g d’agar-agar à la solution. Stériliser en autoclave à 120 “C rt 1 “C pendant 20 min. Ajuster le pH
à 7,0 à 20 OC avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.3.2.4 Solution tampon stérile, pH 7,0 à 20 OC.
Préparer séparément les deux solutions suivantes:
KH2P04 9,l g/l (solution A)
Na2HP04 Il,9 g/l (solution B)
Mélanger 600 ml de solution A avec 400 ml de solution B. Stériliser en autoclave à 120 “C rfr 1 OC pendant 20 min.
Ajuster le pH à 7,0 à 20 “C avec une solution de NaOH stérile à 0,Ol mol/l.
5.4 Pour les essais par enfouissement dans le sol
Utiliser un sol activé ayant une teneur en eau de (60 If: 5) % de la capacité de rétention d’eau du sol (voir annexe A).
La capacité de rétention d’eau est la teneur en eau d’un sol lorsqu’il est saturé d’eau.
Le pH d’un extrait aqueux de sol (1 g de sol dans 20 g d’eau) doit être compris entre 4,0 et 7,0.
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@ ISO
ISO 846: 1997(F)
Déterminer la teneur en eau et la capacité de rétention d’eau du sol conformément à l’annexe A. Si la teneur en
eaux du sol dépasse la valeur susmentionnée, étaler le sol en mince couche dans les conditions ambiantes de
laboratoire. Ne pas chauffer ni laisser sécher le sol car cette opération est susceptible d’altérer la microflore qu’il
contient. Si la teneur en eau doit être augmentée, utiliser une solution aqueuse composée de 1 g de nitrate
d’ammonium et de 0,2 g de phosphate dipotassique par litre d’eau.
6 Éprouvettes
6.1 Forme et dimensions
La forme et les dimensions d es éprouvettes dépendron t des essais devant être effectués après l’exposition aux
champignon s ou bactéries, ou après enfouissement dans le sol.
S’il est nécessaire de déterminer les variations de l’épaisseur des éprouvettes, utiliser des éprouvettes provenant
du matériau original. Si le matériau doit être moulé avant utilisation’ utiliser des éprouvettes de 0,5 mm d’épaisseur
maximale.
S’il est nécessaire de déterminer les variations de masse, utiliser des éprouvettes carrées de 30 mm à 60 mm de
côté et 2 mm d’épaisseur maximale. Lorsqu’on procède à un examen visuel pour estimer les modifications d’aspect,
les dimensions des éprouvettes ne sont pas aussi critiques. Cependant, une épaisseur de 0,5 mm à 2 mm est
recommandée.
Les micro-organismes pouvant attaquer la surface du plastique essayé, seuls les résultats ayant été obtenus à
partir d’éprouvettes de dimensions identiques peuvent être comparés.
62 . Lots d’éprouvettes et nombres dans chaque lot
6.2.1 Lots d’éprouvettes
Préparer trois lots d’éprouvettes par échantillon et par méthode d’essai:
lot 0: éprouvettes témoins, conservées dans les conditions normales de température et d’humidité;
lot 1: éprouvettes ensemencées avec des micro-organismes et incubées;
lot S: éprouvettes stériles, conservées dans les mêmes conditions que celles du lot 1.
6.2.2 Nombre dans chaque lot
visuel, préparer au moins cinq éprouvettes de chaque lot, c’est-à-dire un total d’au moins
Pour l’examen
15 éprouvettes par échantillon et méthode d’essai.
Par
Pour la d étermi nation des variations de masse, préparer au moins six éprouvettes de chaque lot, c’est-à-dire un
rouvettes par échantillon et par méthode d’essai.
total d’au moins 18ép
Pour les autres méthodes d’estimation, utiliser le nombre d’éprouvettes prescrit dans la norme appropriée.
les éprouvettes utilisées pour déterminer les
Effectuer séparément les différentes estimations. Néanmoins,
variations de masse ou d’autres propriétés physiques peuvent également être utilisées pour effectuer l’examen
visuel.
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0 ISO
ISO 846: 1997(F)
7 Préparation des éprouvettes
.
7.1 Nettoyage
Pour les méthodes A et C, plonger les éprouvettes pendant 1 min dans du mélange eau-éthanol (5.1 .l 1 .l ) et les
sécher à 45 “C pendant 4 h, à moins qu’elles ne soient endommagées par I’éthanol. Dans ce dernier cas, conserver
les éprouvettes dans un récipient stérile, en les manipulant avec des brucelles stériles. Effectuer toutes les
manipulations auxquelles les éprouvettes seront ultérieurement soumises en utilisant des brucelles pour éviter toute
contamination organique extérieure.
Ne pas nettoyer les éprouvettes pour les méthodes B, B’ ou D.
7.2 Étiquetage et stockage
Une fois nettoyées et étiquetées munies d’un marquage), conserver les éprouvettes
dans des boîtes de Pet ri
(5.1.8) à la température ambiante
L’étiquetage et le marquage peuvent provoquer des réactions superficielles par le plastique pendant l’essai. Si c’est
le cas, conserver les éprouvettes séparément dans des récipients appropriés (par exemple boîtes de Petri) et
marquer les récipients, non les éprouvettes, afin d’éviter toute réaction superficielle. Dans tous les autres cas, les
éprouvettes peuvent être étiquetées directement à condition d’utiliser un marqueur approprié.
7.3 Conditionnement et pesée
Conserver les lots d’éprouvettes utilisés pour déterminer Oes variations de masse à la température ambiante dans le
dessiccateur (5.1 03) jusqu’à ce que la masse de chaque éprouvette (IIZ~, m2, ma, etc.) soit constante à 0,l mg près
(c’est généralement le cas au bout de 48 h). Noter la masse de chaque éprouvette. Sauf accord contraire, les
éprouvettes utilisées pour l’examen visuel et/ou pour déterminer les variations de propriétés physiques autres que
la masse (5.1.3) ne nécessitent aucun conditionnement à ce stade.
Les parties intéressées peuvent convenir de conserver les éprouvettes dans le dessiccateur (5.1.3) à 45 OC. Dans
ce cas, les refroidir au-dessus d’un gel de silice jusqu’à la température ambiante avant emploi et les conserver
jusqu’à l’obtention d’une masse constante à 20 “C t 1 “C et à (65 + 3) % d’humidité relative. Si ce mode opératoire
est suivi, cela doit être consigné dans le rapport d’essai.
8 Modes opératoires
8.1 Températures d’essai
Préparer et estimer les éprouvettes dans les conditions normales (voir ISO 291) de 23 OC + 1 OC avec une humidité
relative de (50 k 3) %; les incuber à 24 “C + 1 “C ou 29 “6 + 1 “C.
8.2 Méthodes d’essai
Le tableau 3 donne une présentation générale des méthodes d’essai décrites.
Le choix de la méthode et des propriétés à mesurer dépend du matériau soumis à l’essai et des conditions pour
l’emploi prévu.
9
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ISO 846: 1997(F) 0 ISO
Tableau 3 - Présentation générale des méthodes d’essai
Essais par
Essais
Essais avec champignons
enfouissement
avec bactéries
dans le sol
conformément à
Lot d’éprouvettes I S I I I
S S I S l S
Solution pulvérisée
SP-S MS-S SP-S MS-S SP-S
SP-S MS-S Aucune MS-S Aucune MS-S
sur les éprouvettesl)
24 “C I!I 1 “C ou 29 “C + 1 “C 29 “C I!I 1 “C
Conditions
\ I
d’incubation
Au moins 4 semaines;
> 95 % d’humidité relative*)
I
1) SP-S = suspension de spores;
MS-S = solution microbicide.
I
2) Cette humidité est atteinte par le milieu gélosé avec les méthodes A, B, B’ et C. Pour la méthode D, l’incubateur doit
avoir une humidité relative contrôlée d’au moins 95 %.
I I
8.2.1 Essai de croissance des champignons (méthode A)
8.2.1 .l Garnissage des boî
...
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