ISO 7932:1993
(Main)Microbiology — General guidance for the enumeration of Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C
Microbiology — General guidance for the enumeration of Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C
The principle of the method specified is surface plating of a specified quantity of the test sample if the initial product is liquid, or of a specified quantity of an initial suspension in the case of other products, preparing other plates using decimal dilutions of the test sample, aerobic incubation of the plates at 30 °C, calculating the number of B. cereus per gram or per millilitre of sample from the number of confirmed colonies. Applies to products intended for human consumption or animal feeding stuffs.
Microbiologie — Directives générales pour le dénombrement de Bacillus cereus — Méthode par comptage des colonies à 30 degrés C
La présente Norme internationale donne les directives générales pour le dénombrement de Bacillus cereus revivifiable dans les produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale, par comptage des colonies à 30 °C.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
ISO
INTERNATIONAL
7932
STANDARD
Second edition
1993-1 O-l 5
- General guidance for the
Microbiology
enumeration of Bacillus cereus -
Colony-count technique at 30 “C
Microbiologie - Directives g&&ales pour Ie denombrement de Bacillus
- Methode par camptage des colonies 6 30 “C
cereus
Reference number
ISO 7932:1993(E)
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ISO 7932:1993(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the iight to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 7932 was prepared by Technical Committee
ISODC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 9,
Microbiology.
This second edition cancels and replaces the first edition
(ISO 7932:1987), which has been technically revised.
Annex A forms an integral part of this International Standard. Annex B is
for information only.
0 ISO 1993
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form or
by any means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without per-
mission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
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Introduction
0.1 This International Standard is intended to provide general guidance
for the microbiological examination of food products not dealt with by ex-
isting International Standards and to be taken into account by organizations
preparing microbiological methods of test for application to foods or to
animal feeding stuffs. Because of the large variety of products within this
field of application, these guidelines may not be appropriate in every detail
for certain products and for some other products it may be necessary to
use different methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases every
attempt will be made to apply the guidelines provided as far as possible
and that deviations from them will only be made if absolutely necessary
for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which the guide-
lines have been followed and the reasons for deviation from them in the
case of particular products. ’
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
groups of products, International Standards and/or national Standards may
already exist that do not comply with the guidelines. In cases where
International Standards already exist for the product to be tested, they
should be followed, but it is hoped that when such Standards are reviewed
they will be changed to comply with this International Standard so that
eventually the only remaining departures from these guidelines will be
those necessary for weil-established technical reasons.
0.2 For the purposes of a practicable test method, the definition of
Bacillus cereus given in clause 3 and used as a basis for the procedure
does not exclusively describe strains of 5. cereus. In particular, the con-
firmatory tests are inadequate to distinguish between B. cereus and other
closely related but less commonly encountered bacillus species such as
B. anthracis, 6. thuringiensis, 6. mycoides, etc.
0.3 lt appears that the spores of many, if not most, strains of B. cereus
germinate readily on the surface of culture media employed for enumer-
ation. In most cases there does not seem to be a need for heat shock
treatment to provoke germination. Sometimes a heat shock procedure is
desirable, for example for Spore counts or to inhibit growth of vegetative
bacterial cells. In such cases, treatment of 15 min. at 70 “C is rec-
ommended.
. . .
Ill
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This page intentionally lefl blank
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ISO 7932:1993(E)
INTERNATIONAL STANDARD
- General guidance for the enumeration
Microbiology
of Bacillus cereus - Colony-count technique at 30 “C
4 Principle
1 Scope
This International Standard gives general guidance for
Surface plating, on a solid selective culture me-
4.1
the enumeration of viable Bacillus cereus in products
dium contained in Petri dishes, of a specified quantity
intended for human consumption or animal feeding
of the test Sample if the initial product is liquid, or of
stuffs by means of the colony-count technique at
a specified quantity of an initial Suspension in the case
30 “C.
of other products.
Preparation of other plates, under the Same con-
2 Normative references
ditions, using decimal dilutions of the test Sample or
of the initial Suspension.
The following Standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
of this International Standard. At the time of publi-
4.2 Aerobic incubation of the plates at 30 “C for
cation, the editions indicated were valid. All Standards
18hto48h.
are subject to revision, and Parties to agreements
based on this International Standard are encouraged
Calculation of the number of 5. cereus per gram
4.3
to investigate the possibility of applying the most re-
or per millilitre of Sample from the number of con-
cent editions of the Standards indicated below.
firmed colonies obtained on plates at dilution levels
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
chosen so as to give a significant result, and confir-
rently valid International Standards.
mation according to the tests specified.
ISO 6887: 1983, Microbiology - General guidance for
the preparation of dilutions for microbiological exam-
5 Diktion fluid, culture media and
ina tion.
reagents
ISO 72 18: 1985, Microbiology - General guidance for
microbiological examina tions. 5.1 General
For current laboratoty practice, see ISO 7218.
3 Definition
Commercially prepared ready-to-use reagents
NOTE 1
For the purposes of this International Standard, the
may be used.
following definition applies.
5.2 Dilution fluid
3.1 Bacillus cereus: A microorganism that forms
colonies on the surface of a selective culture medium
See ISO 6887 and any specific Standard dealing with
and which gives positive confirmation reactions under
the product to be examined.
the conditions specified in this International Standard.
1
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ISO 7932:1993(E)
Shell to the other. Put the yolks into a sterile measur-
5.3 Agar medium (see reference [l] in
ing cylinder and add four Parts by volume of sterile
annex B)
water. Transfer aseptically into a sterile flask (6.7) and
mix vigorously.
5.3.1 Base medium
Heat the mixture for 2 h in a water bath (6.4) set at
45 “C. Then leave for 18 h to 24 h at 0 “C to 5 “C to
5.3.1 .l Composition
allow a precipitate to form.
Collect the supernatant emulsion aseptically.
Beef extract 1,o g
The emulsion may be stored at 0 “C to 5 “C for not
Peptone
no g
longer than 72 h.
D-Mannit01
no g
Sodium chloride (NaCI)
no g
5.3.4 Complete medium (MYP agar)
Phenol red 0,025 g
Agar 12to18g’)
5.3.4.1 Composition
Water 900 ml
90 ml
Base medium (5.3.1)
1) Depending on the gel strength of the agar.
1,O ml
Polymyxin B Solution (5.3.2)
IO,0 ml
Egg yolk emulsion (5.3.3)
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete
5.3.4.2 Preparation
medium in the water, by heating if necessary.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
Melt the base medium and cool it in a water bath
it is 7,2 at 25 “C.
(6.4) set at 50 “C.
Dispense the medium in quantities of 90 ml into
Add the other liquids, mixing weil after each addition.
flasks (6.7) of appropriate capacity.
Cool the complete medium in a water bath (6.4) at
Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at
45 “C.
121 “C.
5.3.5 Preparation of agar plates for enumeration
5.3.2 Polymyxin B solution
Pour 15 ml to 20 ml portions of the completeImedium
(5.3.4) into sterile Petri dishes (6.8) and allow to
5.3.2.1 Composition
solidify.
The plates may be stored Prior to drying at between
106 I.U.
0 “C and 5 “C for up to 4 days.
100 ml
Immediately before use, dry the plates, preferably
with the lids off and the agar surface downwards, in
a drying cabinet or incubator (6.2) set between 37 “C
and 55 “C until the agar surface is dry.
5.3.2.2 Preparation
Dissolve the polymyxin B sulfate in the water. Sterilize
Preparation of agar plates for isolation
5.3.6
by f iltration.
Pour portions of about 15 ml of the base medium
5.3.3 Egg yolk emulsion
(5.3.1), previously melted, cooled and kept in a water
bath (6.4) at 45 “C, into sterile Petri dishes (6.8) and
Use fresh hens’ eggs with their shells intact. Wash
allow to solidify.
the eggs, using a brush, in liquid detergent. Rinse
Immediately before use, dry the plates, preferably
under running water, dip in 95 % (WV) ethanol for
with the lids off and the agar surface downwards, in
30 s and dry. Using aseptic procedures, break each
a drying cabinet or incubator (6.2) set between 37 “C
egg and separate the yolk from the white by repeat-
and 55 “C until the agar surface is dry.
edly transferring the yolk from one half of the egg
2
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ISO 7932:1993(E)
5.4 Glucose agar Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at
121 “C.
5.4.1 Composition
5.6 Voges-Proskauer (VP) test reagents
Tryptone
IO,0 g
5.6.1 a-Naphthol Solution
Yeast extract
1,5 g
5.6.1 .l Composition
Glucose
IO,0 g
Sodium chloride (NaCI)
5,O g
Bromocresol purple 0,015 g a-Naphthol
5,O g
Agar
12to18g’) 100 ml
Ethanol, 95 % (VW)
Water 1 000 ml
5.6.1.2 Preparation
1) Depending on the gel strength of the agar.
Dissolve the a-naphthol in the ethanol.
5.4.2 Preparation
Store at between 0 “C and 5 “C in a hermetically
sealed brown culture flask.
Dissolve the components or the dehydrated complete
medium in the water, by heating if necessary.
5.6.2 Potassium hydroxide Solution
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
5.6.2.1 Composition
it is 7,0 at 25 “C.
Dispense the culture medium in quantities of 15 ml
into test tubes (6.7).
Potassium hydroxide (KOH)
40 g
Water 100 ml
Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at
121 “C.
Immediately before use, melt the medium in a boiling
5.6.2.2 Preparation
water bath or flowing steam for IO min, then cool
rapidly to about 30 “C, keeping the tubes in a vertical
Dissolve the potassium hydroxide slowly in the water.
Position.
5.6.3 Creatine, crystalline.
5.5 Voges-Proskauer (VP) medium
5.7 Nitrate medium
5.5.1 Composition
5.7.1 Composition
Peptone
7,o g
Glucose
5,o g
Peptone
5,o g
Dipotassium hydrogen
5,O g
Beef extract
3,o g
Phosphate (K,HPO,)
Potassium nitrate (KNO,)
w g
Sodium chloride (NaCI)
50 g
Water 1 000 ml
Water 1 000 ml
5.5.2 Preparation 5.7.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete Dissolve the components or the dehydrated complete
medium in the water. medium in the water.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
it is 7,0 at 25 “C.
it is 7,0 at 25 “C.
Dispense the medium in quantities of 5 ml into test Dispense the medium in quantities of 5 ml into test
tubes (6.7). tubes (6.7).
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ISO 7932:1993(E)
Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at
Discard immediately any unused complete reagent.
121 “C.
5.9 Zinc dust
5.8 Nitrite reagent
6 Apparatus and glassware
5.8.1 5-Amino-2-naphthalenesulfonic acid
(5-2 ANSA) Solution
NOTE 3 Disposable apparatus is an acceptable alterna-
tive to reusable glassware if it has similar specifications.
5.8.1 .l Composition
Usual microbiological laboratory equipment and, in
particular, the following.
5-2 ANSA
OJ g
Acetic acid (2,6 mol/l) 100 ml
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
sterilization (autoclave)
See ISO 7218.
5.8.1.2 Preparation
6.2 Drying cabinet or incubator, ventilated by con-
Dissolve the 5-2 ANSA in the acetic acid and filter
vection, for drying the agar plates, capable of operat-
through Paper?
ing between 37 “C + 1 “C and 55 “C + 1 “C.
- -
Store in a weil-stoppered brown culture flask (prefer-
ably with a bulb-type dropper) between 0 “C and
6.3 Incubator, capable of operating at 30 “C +
-
5 “C.
1 “C.
NOTE 2 If 5-2 ANSA is not available, it is possible to use
the following alternative reagent:
6.4 Water baths, capable of being maintained at
45 “C + 0,5 “C and 50 “C + 1 “C.
- -
Solution A: sulfanilic acid, 0,8 g
acetic acid (5 mol/l), 100 ml; and
6.5 Loops, made of platinum/iridium or
nickel/chromium wire, approximately 3 mm in diam-
Solution B: cc-naphthol, 0,5 g
eter, and stab-inoculation wires of the same ma-
acetic acid (5 mol/l), 100 ml.
terial.
5.8.2 Sulfanilic acid Solution
6.6 pH-meter, accurate to within + 0,l pH units at
-
25 “C.
5.8.2.1 Composition
6.7 Test tubes, in particular of diameter 18 mm and
length 180 mm, and culture flasks*) f
...
NORME ISO
7932
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1993-I o-1 5
- Directives générales pour
Microbiologie
le dénombrement de Bacihs cereus -
Méthode par comptage des colonies à
30 “C
Microbiology - General guidance for the enumeration of Bacillus
cereus - Colony-Count technique at 30 “C
Numéro de référence
ISO 7932:1993(F)
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ISO 7932:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7932 a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7932:1987), dont elle constitue une révision technique.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
L’annexe B est donnée uniquement à titre d’information.
0 ISO 1993
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
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ISO 7932:1993(F)
Introduction
0.1 La présente Norme internationale se propose de fournir des directi-
ves générales pour l’examen microbiologique de produits alimentaires non
concernés par les Normes internationales existant actuellement et à
prendre en consideration par les organismes élaborant des methodes
d’essais microbiologiques destinées à être appliquées à des produits ali-
mentaires ou à des aliments pour animaux. En raison de la grande diversité
des produits entrant dans ce domaine d’application, il est possible que ces
directives, dans tous leurs détails, ne conviennent pas exactement à cer-
tains produits et que, pour certains autres produits, il puisse être néces-
saire d’employer des méthodes différentes. Néanmoins, il est à espérer
que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque
fois qu’il sera possible, les directives données, et qu’on n’aura recours à
des dérogations que si cela est absolument necessaire pour des raisons
techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront eté suivies et les raisons pour
lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
Normes nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec ces
directives. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà pour
le produit à contrôler, elles devront être appliquées, mais il serait souhai-
table que, lorsqu’elle viendront en révision, elles soient modifiées de façon
à se conformer à la présente Norme internationale, si bien que, finalement,
les seules divergences restantes seront celles vraiment nécessaires pour
des raisons techniques bien établies.
0.2 Pour les besoins d’une méthode d’essai pratique, la définition de
Bacillus cereus donnée au chapitre 3 et utilisée comme base pour le mode
opératoire, ne décrit pas d’une manière spécifique les souches de Bacihs
cereus. Les essais de confirmation notamment sont insuffisants pour dis-
tinguer B. cereus des autres bacillus proches, mais moins communément
rencontrés, tels que B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, etc.
0.3 II apparaît que les spores de beaucoup de souches de B. cereus, si-
non la plupart, germent aisément à la surface du milieu de culture utilisé
pour le dénombrement. Dans la plupart des cas, il ne semble pas qu’il y
ait besoin d’un traitement de choc thermique pour provoquer la
germination. Parfois ce traitement de choc thermique est souhaitable, par
exemple pour le dénombrement des spores ou l’inhibition de cellules vé-
gétatives de micro-organismes; dans ce cas, il sera de 15 min à 70 “C.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 7932:1993(F)
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement de Bacillus cereus - Méthode par
comptage des colonies à 30
1 Domaine d’application 4 Principe
La présente Norme internationale donne les directives
générales pour le dénombrement de Bacihs cereus
4.1 Ensemencement en surface d’un milieu sélectif
revivifiable dans les produits destinés à la consom-
solide coulé dans des boîtes de Petri, avec une quan-
mation humaine ou à l’alimentation animale, par
tité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit
comptage des colonies à 30 “C.
est liquide, ou de la suspension mère dans le cas
d’autres produits.
Dans les mêmes conditions, ensemencement des di-
2 Références normatives
lutions décimales obtenues à partir de l’échantillon
pour essai ou de la suspension mère.
normes suivantes contiennent des dispositions
Les
.
par suite de la référence qui en est faite, consti-
WJ’ I
tuent des dispositions valables pour la présente
4.2 Incubation de ces boîtes en aérobiose à 30 “C
Norme internationale. Au moment de la publication,
pendant 18 h à 48 h.
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
norme est sujette à révision et les parties prenantes
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli- 4.3 Calcul du nombre de 5. cereus, par millilitre ou
quer les éditions les plus récentes des normes par gramme d’échantillon, à partir du nombre de co-
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO lonies caractéristiques obtenues dans des boîtes
possèdent le registre des Normes internationales en choisies aux niveaux de dilution donnant un résultat
vigueur à un moment donné. significatif et confirmées selon les essais spécifiés.
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
5 Diluant, milieux de culture et réactifs
ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
pour les examens microbiologiques.
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
3 Définition I’ISO 7218.
NOTE 1 Les réactifs ou préparations du commerce prêts
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
à l’emploi peuvent être utilisés.
la définition suivante s’applique.
3.1 Bacillus cereus: Micro-organisme qui forme des
colonies à la surface d’un milieu de culture sélectif et 5.2 Diluant
qui donne des réactions de confirmation positives
quand les essais sont exécutés selon la méthode Voir I’ISO 6887 et la norme spécifique du produit à
spécifiée dans la présente Norme internationale. analyser.
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ISO 7932:1993(F)
5.3 Milieu gélosé (voir référence CII en ter quatre parties en volume d’eau stérile. Transférer
de façon aseptique dans un flacon stérile (6.7) et mé-
annexe B.
langer vigoureusement.
5.3.1 Milieu de base
Porter le mélange au bain d’eau (6.4) réglé à 45 “C
pendant 2 h et entreposer entre 0 “C et 5 “C pendant
5.3.1 .l Composition 18 h à 24 h pour permettre au précipité de se former.
Recueillir aseptiquement l’émulsion surnageante.
Extrait de viande
l,O g
L’émulsion peut être conservée entre 0 “C et 5 “C au
maximum pendant 72 h.
Peptone
IW g
D-Mannitol
no g
5.3.4 Milieu complet (agar-agar MYP)
Chlorure de sodium (NaCI)
lao g
Rouge de phénol 0,025 g
5.3.4.1 Composition
Agar-agar 12 à 18 g 1)
Eau 900 ml
90 ml
Milieu de base (5.3.1)
1,0 ml
Solution de polymyxine B (5.3.2)
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Émulsion de jaune d’œuf (5.3.3) 10,O ml
5.3.1.2 Préparation
5.3.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
hydraté dans l’eau, en chauffant, si nécessaire.
Faire fondre le milieu de base puis le refroidir au bain
d’eau (6.4) réglé à 50 “C.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
sation il’ soit de 7,2 à 25 “C.
Ajouter les autres liquides en mélangeant soi-
gneusement après chaque addition.
Répartir le milieu par quantités de 90 ml dans des
flacons de culture (6.7) de capacité appropriée.
Refroidir le milieu complet dans un bain d’eau (6.4) à
45 “C.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
15 min.
5.3.5 Préparation des boîtes de milieu gélosé
pour le dénombrement
5.3.2 Solution de polymyxine B
Couler 15 ml à 20 ml de milieu complet (5.3.4) dans
5.3.2.1 Composition
des boîtes de Petri (6.8) stériles et laisser se solidifier.
Les boîtes peuvent être conservées, avant séchage,
,
jusqu’à 4 jours au maximum entre 0 “C et 5 “C.
Sulfate de polymyxine B 106 U.I.
Eau 100 ml
Immédiatement avant utilisation, sécher les boîtes,
de préférence couvercle enlevé et surface de la
gélose tournée vers le bas, dans une enceinte de sé-
chage ou une étuve (6.2) réglée entre 37 “C et 55 “C
5.3.2.2 Préparation
jusqu’à séchage de la surface de la gélose.
Dissoudre le sulfate de polymyxine B dans l’eau. Sté-
5.3.6 Préparation des boîtes de milieu gélosé
riliser par filtration.
pour l’isolement
5.3.3 Émulsion de jaune d’œuf
Verser dans les boîtes de Petri (6.8) stériles environ
15 ml de milieu de base (5.3.1) fondu au préalable,
Utiliser des oeufs frais de poule, à coquille intacte.
puis refroidi et maintenu au bain d’eau (6.4) à 45 “C
Nettoyer les oeufs avec une brosse, à l’aide d’un dé-
et laisser se solidifier.
tergent liquide. Les rincer à l’eau courante, les plonger
dans de l’alcool à 95 % (WV) pendant 30 s et les sé- Immédiatement avant l’emploi, faire sécher les boî-
cher. En opérant de façon aseptique, casser chaque tes, de préférence ouvertes, avec la surface de la
œuf et séparer les jaunes des blancs par transferts gélose orientée vers le bas dans une enceinte de sé-
répétés du jaune d’une demi coquille dans l’autre. chage ou une étuve (6.2) entre 37 “C et 55 “C jusqu’à
séchage de la surface de la gélose.
Placer les jaunes dans une éprouvette stérile et ajou-
2
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ISO 7932:1993(F)
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
5.4 Gélose glucosée
15 min.
5.4.1 Composition
5.6 Réactifs pour la réaction de
Voges-Proskauer (VP)
Tryptone IW g
Extrait de levure
If5 g 5.6.1 Solution d’wnaphtol
Glucose
lw) g
5.6.1 .l Composition
Chlorure de sodium (NaCI)
58 g
Pourpre de bromocrésol 0,015 g
12à 18gl)
Agar-agar 5,o g
100 ml
1 000 ml Éthanol à 95 % (WV)
Eau
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
5.6.1.2 Préparation
Dissoudre l’a-naphtol dans I’éthanol.
5.4.2 Préparation
Conserver entre 0 “C et 5 “C dans un flacon en verre
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
brun bouché hermétiquement.
hydraté dans l’eau en chauffant, si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili- 5.6.2 Hydroxyde de potassium, solution.
sation il soit de 7,0 à 25 “C.
5.6.2.1 Composition
Répartir le milieu de culture par quantités de 15 ml
dans des tubes (6.7).
Hydroxyde de potassium (KOH)
40,o g
Stériliser le milieu à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C
pendant 15 min. 100 ml
Eau
1
Juste avant l’emploi, faire fondre le milieu au bain
d’eau bouillante ou par jet de vapeur pendant
10 min. Ensuite, refroidir rapidement à 30 “C environ
5.6.2.2 Préparation
en maintenant les tubes en position verticale.
Dissoudre l’hydroxyde de potassium lentement dans
l’eau.
5.5 Milieu de Voges-Proskauer (VP)
5.6.3 Créatine, en cristaux
5.5.1 Composition
5.7 Milieu au nitrate
Peptone 70 g
Glucose 58 g
5.7.1 Composition
Dihydrogénophosphate de potas-
510 g
sium (K,H PO,)
Peptone 510 g
Chlorure de sodium (NaCI)
510 g
Extrait de viande 3,o g
Eau 1 000 ml
Nitrate de potassium (KN03) IlO g
1 000 ml
Eau
5.5.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
5.7.2 Préparation
hydraté dans l’eau.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dans
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
l’eau.
sation il soit de 7,0 à 25 “C.
Répartir le milieu dans des tubes (6.7) par quantités Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
de 5 ml. sation il soit de 7,0 à 25 OC.
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 7932:1993(F)
Répartir le milieu dans des tubes (6.7) par quantités 5.8.3 Préparation du réactif complet
de 5 ml.
Juste avant l’emploi, mélanger des volumes égaux
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant des deux solutions acides (5.8.1 et 5.8.2).
15 min.
Ne pas utiliser le réactif restant.
5.8 Réactif pour la recherche des nitrites
5.9 Zinc pulvérulent
5.81 Acide 5-amino-2-naphtalène sulfonique
6 Appareillage et verrerie
(5-2 ANSA), solution.
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
58.1 .l Composition
même titre que la verrerie réutilisable, si ces spécifications
sont similaires.
.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et
5-2 ANSA OfI g
en particulier, ce qui suit.
Acide acétique (2,6 mol/l) 100 ml
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche
(four) ou en chaleur humide (autoclave)
5.8.1.2 Préparation
Voir ISO 7218.
Dissoudre le 5-2 ANSA dans l’acide acétique et filtrer
sur papier?
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, ventilée par
convection, pour le séchage des boîtes de gélose,
Conserver dans un flacon de culture en verre brun,
réglable entre 37 “C + 1 “C et 55 “C + 1 “C.
bien bouché (de préférence de type compte-gouttes) - -
entre 0 “C et 5 “C
6.3 Étuve, réglable à 30 “C + - 1 “C.
NOTE 2 Si le 5-2 ANSA n’est pas disponible, il est possi-
ble d’utiliser, en variante, le réactif suivant:
6.4 Bains d’eau, réglables à 45 “C + 0,5 “C et à
-
Solution A: acide sulfanilique, 0,8 g
50 “C + 1 “C.
-
acide acétique (5 mol/l), 100 ml, et
6.5 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-
Solution B: a-naphtol 0,5 g
chrome, d’environ 3 mm de diamètre et fil à ense-
acide acétique (5 mol/l), 100 ml.
mencer de même métal.
6.6 pH-mètre, ayant une précision de réglage de
5.8.2 Solution d’acide
...
NORME ISO
7932
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1993-I o-1 5
- Directives générales pour
Microbiologie
le dénombrement de Bacihs cereus -
Méthode par comptage des colonies à
30 “C
Microbiology - General guidance for the enumeration of Bacillus
cereus - Colony-Count technique at 30 “C
Numéro de référence
ISO 7932:1993(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 7932:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7932 a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7932:1987), dont elle constitue une révision technique.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
L’annexe B est donnée uniquement à titre d’information.
0 ISO 1993
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 7932:1993(F)
Introduction
0.1 La présente Norme internationale se propose de fournir des directi-
ves générales pour l’examen microbiologique de produits alimentaires non
concernés par les Normes internationales existant actuellement et à
prendre en consideration par les organismes élaborant des methodes
d’essais microbiologiques destinées à être appliquées à des produits ali-
mentaires ou à des aliments pour animaux. En raison de la grande diversité
des produits entrant dans ce domaine d’application, il est possible que ces
directives, dans tous leurs détails, ne conviennent pas exactement à cer-
tains produits et que, pour certains autres produits, il puisse être néces-
saire d’employer des méthodes différentes. Néanmoins, il est à espérer
que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque
fois qu’il sera possible, les directives données, et qu’on n’aura recours à
des dérogations que si cela est absolument necessaire pour des raisons
techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront eté suivies et les raisons pour
lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
Normes nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec ces
directives. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà pour
le produit à contrôler, elles devront être appliquées, mais il serait souhai-
table que, lorsqu’elle viendront en révision, elles soient modifiées de façon
à se conformer à la présente Norme internationale, si bien que, finalement,
les seules divergences restantes seront celles vraiment nécessaires pour
des raisons techniques bien établies.
0.2 Pour les besoins d’une méthode d’essai pratique, la définition de
Bacillus cereus donnée au chapitre 3 et utilisée comme base pour le mode
opératoire, ne décrit pas d’une manière spécifique les souches de Bacihs
cereus. Les essais de confirmation notamment sont insuffisants pour dis-
tinguer B. cereus des autres bacillus proches, mais moins communément
rencontrés, tels que B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, etc.
0.3 II apparaît que les spores de beaucoup de souches de B. cereus, si-
non la plupart, germent aisément à la surface du milieu de culture utilisé
pour le dénombrement. Dans la plupart des cas, il ne semble pas qu’il y
ait besoin d’un traitement de choc thermique pour provoquer la
germination. Parfois ce traitement de choc thermique est souhaitable, par
exemple pour le dénombrement des spores ou l’inhibition de cellules vé-
gétatives de micro-organismes; dans ce cas, il sera de 15 min à 70 “C.
. . .
III
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Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 7932:1993(F)
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement de Bacillus cereus - Méthode par
comptage des colonies à 30
1 Domaine d’application 4 Principe
La présente Norme internationale donne les directives
générales pour le dénombrement de Bacihs cereus
4.1 Ensemencement en surface d’un milieu sélectif
revivifiable dans les produits destinés à la consom-
solide coulé dans des boîtes de Petri, avec une quan-
mation humaine ou à l’alimentation animale, par
tité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit
comptage des colonies à 30 “C.
est liquide, ou de la suspension mère dans le cas
d’autres produits.
Dans les mêmes conditions, ensemencement des di-
2 Références normatives
lutions décimales obtenues à partir de l’échantillon
pour essai ou de la suspension mère.
normes suivantes contiennent des dispositions
Les
.
par suite de la référence qui en est faite, consti-
WJ’ I
tuent des dispositions valables pour la présente
4.2 Incubation de ces boîtes en aérobiose à 30 “C
Norme internationale. Au moment de la publication,
pendant 18 h à 48 h.
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
norme est sujette à révision et les parties prenantes
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli- 4.3 Calcul du nombre de 5. cereus, par millilitre ou
quer les éditions les plus récentes des normes par gramme d’échantillon, à partir du nombre de co-
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO lonies caractéristiques obtenues dans des boîtes
possèdent le registre des Normes internationales en choisies aux niveaux de dilution donnant un résultat
vigueur à un moment donné. significatif et confirmées selon les essais spécifiés.
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
5 Diluant, milieux de culture et réactifs
ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
pour les examens microbiologiques.
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
3 Définition I’ISO 7218.
NOTE 1 Les réactifs ou préparations du commerce prêts
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
à l’emploi peuvent être utilisés.
la définition suivante s’applique.
3.1 Bacillus cereus: Micro-organisme qui forme des
colonies à la surface d’un milieu de culture sélectif et 5.2 Diluant
qui donne des réactions de confirmation positives
quand les essais sont exécutés selon la méthode Voir I’ISO 6887 et la norme spécifique du produit à
spécifiée dans la présente Norme internationale. analyser.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 7932:1993(F)
5.3 Milieu gélosé (voir référence CII en ter quatre parties en volume d’eau stérile. Transférer
de façon aseptique dans un flacon stérile (6.7) et mé-
annexe B.
langer vigoureusement.
5.3.1 Milieu de base
Porter le mélange au bain d’eau (6.4) réglé à 45 “C
pendant 2 h et entreposer entre 0 “C et 5 “C pendant
5.3.1 .l Composition 18 h à 24 h pour permettre au précipité de se former.
Recueillir aseptiquement l’émulsion surnageante.
Extrait de viande
l,O g
L’émulsion peut être conservée entre 0 “C et 5 “C au
maximum pendant 72 h.
Peptone
IW g
D-Mannitol
no g
5.3.4 Milieu complet (agar-agar MYP)
Chlorure de sodium (NaCI)
lao g
Rouge de phénol 0,025 g
5.3.4.1 Composition
Agar-agar 12 à 18 g 1)
Eau 900 ml
90 ml
Milieu de base (5.3.1)
1,0 ml
Solution de polymyxine B (5.3.2)
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
Émulsion de jaune d’œuf (5.3.3) 10,O ml
5.3.1.2 Préparation
5.3.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
hydraté dans l’eau, en chauffant, si nécessaire.
Faire fondre le milieu de base puis le refroidir au bain
d’eau (6.4) réglé à 50 “C.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
sation il’ soit de 7,2 à 25 “C.
Ajouter les autres liquides en mélangeant soi-
gneusement après chaque addition.
Répartir le milieu par quantités de 90 ml dans des
flacons de culture (6.7) de capacité appropriée.
Refroidir le milieu complet dans un bain d’eau (6.4) à
45 “C.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
15 min.
5.3.5 Préparation des boîtes de milieu gélosé
pour le dénombrement
5.3.2 Solution de polymyxine B
Couler 15 ml à 20 ml de milieu complet (5.3.4) dans
5.3.2.1 Composition
des boîtes de Petri (6.8) stériles et laisser se solidifier.
Les boîtes peuvent être conservées, avant séchage,
,
jusqu’à 4 jours au maximum entre 0 “C et 5 “C.
Sulfate de polymyxine B 106 U.I.
Eau 100 ml
Immédiatement avant utilisation, sécher les boîtes,
de préférence couvercle enlevé et surface de la
gélose tournée vers le bas, dans une enceinte de sé-
chage ou une étuve (6.2) réglée entre 37 “C et 55 “C
5.3.2.2 Préparation
jusqu’à séchage de la surface de la gélose.
Dissoudre le sulfate de polymyxine B dans l’eau. Sté-
5.3.6 Préparation des boîtes de milieu gélosé
riliser par filtration.
pour l’isolement
5.3.3 Émulsion de jaune d’œuf
Verser dans les boîtes de Petri (6.8) stériles environ
15 ml de milieu de base (5.3.1) fondu au préalable,
Utiliser des oeufs frais de poule, à coquille intacte.
puis refroidi et maintenu au bain d’eau (6.4) à 45 “C
Nettoyer les oeufs avec une brosse, à l’aide d’un dé-
et laisser se solidifier.
tergent liquide. Les rincer à l’eau courante, les plonger
dans de l’alcool à 95 % (WV) pendant 30 s et les sé- Immédiatement avant l’emploi, faire sécher les boî-
cher. En opérant de façon aseptique, casser chaque tes, de préférence ouvertes, avec la surface de la
œuf et séparer les jaunes des blancs par transferts gélose orientée vers le bas dans une enceinte de sé-
répétés du jaune d’une demi coquille dans l’autre. chage ou une étuve (6.2) entre 37 “C et 55 “C jusqu’à
séchage de la surface de la gélose.
Placer les jaunes dans une éprouvette stérile et ajou-
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 7932:1993(F)
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
5.4 Gélose glucosée
15 min.
5.4.1 Composition
5.6 Réactifs pour la réaction de
Voges-Proskauer (VP)
Tryptone IW g
Extrait de levure
If5 g 5.6.1 Solution d’wnaphtol
Glucose
lw) g
5.6.1 .l Composition
Chlorure de sodium (NaCI)
58 g
Pourpre de bromocrésol 0,015 g
12à 18gl)
Agar-agar 5,o g
100 ml
1 000 ml Éthanol à 95 % (WV)
Eau
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
5.6.1.2 Préparation
Dissoudre l’a-naphtol dans I’éthanol.
5.4.2 Préparation
Conserver entre 0 “C et 5 “C dans un flacon en verre
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
brun bouché hermétiquement.
hydraté dans l’eau en chauffant, si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili- 5.6.2 Hydroxyde de potassium, solution.
sation il soit de 7,0 à 25 “C.
5.6.2.1 Composition
Répartir le milieu de culture par quantités de 15 ml
dans des tubes (6.7).
Hydroxyde de potassium (KOH)
40,o g
Stériliser le milieu à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C
pendant 15 min. 100 ml
Eau
1
Juste avant l’emploi, faire fondre le milieu au bain
d’eau bouillante ou par jet de vapeur pendant
10 min. Ensuite, refroidir rapidement à 30 “C environ
5.6.2.2 Préparation
en maintenant les tubes en position verticale.
Dissoudre l’hydroxyde de potassium lentement dans
l’eau.
5.5 Milieu de Voges-Proskauer (VP)
5.6.3 Créatine, en cristaux
5.5.1 Composition
5.7 Milieu au nitrate
Peptone 70 g
Glucose 58 g
5.7.1 Composition
Dihydrogénophosphate de potas-
510 g
sium (K,H PO,)
Peptone 510 g
Chlorure de sodium (NaCI)
510 g
Extrait de viande 3,o g
Eau 1 000 ml
Nitrate de potassium (KN03) IlO g
1 000 ml
Eau
5.5.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-
5.7.2 Préparation
hydraté dans l’eau.
Dissoudre les composants ou le milieu complet dans
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
l’eau.
sation il soit de 7,0 à 25 “C.
Répartir le milieu dans des tubes (6.7) par quantités Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérili-
de 5 ml. sation il soit de 7,0 à 25 OC.
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ISO 7932:1993(F)
Répartir le milieu dans des tubes (6.7) par quantités 5.8.3 Préparation du réactif complet
de 5 ml.
Juste avant l’emploi, mélanger des volumes égaux
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant des deux solutions acides (5.8.1 et 5.8.2).
15 min.
Ne pas utiliser le réactif restant.
5.8 Réactif pour la recherche des nitrites
5.9 Zinc pulvérulent
5.81 Acide 5-amino-2-naphtalène sulfonique
6 Appareillage et verrerie
(5-2 ANSA), solution.
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
58.1 .l Composition
même titre que la verrerie réutilisable, si ces spécifications
sont similaires.
.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et
5-2 ANSA OfI g
en particulier, ce qui suit.
Acide acétique (2,6 mol/l) 100 ml
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche
(four) ou en chaleur humide (autoclave)
5.8.1.2 Préparation
Voir ISO 7218.
Dissoudre le 5-2 ANSA dans l’acide acétique et filtrer
sur papier?
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, ventilée par
convection, pour le séchage des boîtes de gélose,
Conserver dans un flacon de culture en verre brun,
réglable entre 37 “C + 1 “C et 55 “C + 1 “C.
bien bouché (de préférence de type compte-gouttes) - -
entre 0 “C et 5 “C
6.3 Étuve, réglable à 30 “C + - 1 “C.
NOTE 2 Si le 5-2 ANSA n’est pas disponible, il est possi-
ble d’utiliser, en variante, le réactif suivant:
6.4 Bains d’eau, réglables à 45 “C + 0,5 “C et à
-
Solution A: acide sulfanilique, 0,8 g
50 “C + 1 “C.
-
acide acétique (5 mol/l), 100 ml, et
6.5 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-
Solution B: a-naphtol 0,5 g
chrome, d’environ 3 mm de diamètre et fil à ense-
acide acétique (5 mol/l), 100 ml.
mencer de même métal.
6.6 pH-mètre, ayant une précision de réglage de
5.8.2 Solution d’acide
...
Questions, Comments and Discussion
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