ISO 7932:1987
(Main)Microbiology — General guidance for enumeration of Bacillus cereus — Colony count technique at 30 degrees C
Microbiology — General guidance for enumeration of Bacillus cereus — Colony count technique at 30 degrees C
Microbiologie — Directives générales pour le dénombrement de Bacillus cereus — Méthode par comptage des colonies à 30 degrés C
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
IS0
INTERNATIONAL STANDARD
7932
First edition
1987-1 1-01
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXAYHAPOAHAA OPrAHM3AuMR Il0 CTAHAAPTM3AuMM
Microbiology - General guidance for enumeration of
Baci//us cereus - Colony count technique at 30 OC
Microbiologie - Directives générales pour le dénombrement de Bacillus cereus - Méthode
par comptage des colonies à 30 OC
Reference number
LSO 7932 : 1987 (E)
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Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through IS0 technical committees. Each member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the IS0 Council. They are approved in accordance with IS0 procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard IS0 7932 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products.
Users should note that all International Standards undergo revision from time to time
and that any reference made herein to any other International Standard implies its
latest edition, unless otherwise stated.
0 International Organization for Standdrdization, 1987 O
Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD IS0 7932 : 1987 (E)
Microbiology - General guidance for enumeration of
Baci//us cereus - Colony count technique at 30 OC
1 Scope and field of application
O introduction
This International Standard gives general guidance for the
0.1 This International Standard is intended to provide general
enumeration of viable Bacillus cereus in products intended for
guidance for the microbiological examination of food products
human consumption or feeding of animals by means of the
not dealt with by existing International Standards and to be
colony count technique at 30 OC.
0
taken into consideration by bodies preparing microbiological
methods of test for application to foods or to animal feeding
stuffs.
2 Reference
IS0 6887, Microbiology - General guidance for the prepara-
Because of the large variety of products within this field of ap-
tion of dilutions for microbiological examination.
plication, these guidelines may not be appropriate for some
products in every detail, and for some other products it may be
necessary to use different methods.
3 Definition
Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be
For the purposes of this International Standard, the following
made to apply the guidelines provided as far as possible and
definition applies.
that deviations from them will only be made if absolutely
necessary for technical reasons.
Bacillus cereus : A micro-organism that forms colonies on the
surface of a selective culture medium and which gives positive
When this International Standard is next reviewed, account will
confirmation reactions under the conditions specified in this
be taken of all information then available regarding the extent
International Standard.
to which the guidelines have been followed and the reasons for
deviation from them in the case of particular products.
4 Principle
The harmonization of test methods cannot be immediate and,
for certain groups of products, International Standards and/or
4.1 Surface plating, on a solid selective culture medium con-
national standards may already exist that do not comply with
0
tained in Petri dishes, of a specified quantity of the test sample
the guidelines. In cases where International Standards already
if the initial product is liquid, or of a specified quantity of an
exist for the product to be tested, they should be followed, but
initial suspension in the case of other products.
it is hoped that when such standards are reviewed they will be
changed to comply with this International Standard so that
Preparation of other plates, under the same conditions, using
eventually the only remaining departures from these guidelines
decimal dilutions of the test sample or of the initial suspension.
will be those necessary for well-established technical reasons.
4.2 Aerobic incubation of the plates at 30 OC for 18 to 48 h.
0.2 For the purposes of a practicable test method, the defini-
tion of Bacillus cereus given in clause 3 and used as a basis for
4.3 Calculation of the number of Bacillus cereus per gram or
the procedure does not exclusively describe strains of B.
per millilitre of sample from the number of confirmed colonies
cereus. In particular, the confirmatory tests are inadequate to
obtained on plates at dilution levels chosen so as to give a
distinguish between B. cereus and other closely related but less
significant result, and confirmation according to the tests
commonly encountered bacillus species such as B. anfhracis,
specified.
B. thuringiensis, B. cereus var. mycoides, etc.
5 Diluent, media and reagents
0.3 It appears that the spores of many, if not most, strains of
Bacillus cereus germinate readily on the surface of culture
media employed for enumeration. In most cases there does not
5.1 Basic materials.
seem to be a need for heat shock treatment to provoke ger-
In order to improve the reproducibility of the results, it is
mination. Sometimes a heat shock procedure is desirable, for
recommended that, for the preparation of the culture medium,
example for spore counts or to inhibit micro-organisms. In such
dehydrated basic components, or complete dehydrated media
cases a treatment of 15 min at 70 OC is recommended.
1
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IS0 7932 : 1987 (E)
and, for the egg yolk emulsion, a commercially available 5.3.3 Egg yolk, emulsion.
preparation, be used. The manufacturer's instructions shall be
Use fresh hen's eggs with their shells intact. Wash the eggs,
rigorously followed.
using a brush, in liquid detergent, rinse under running water,
The chemical products used shall be of recognized analytical
dip in 95 % ( V/ v) ethanol for 30 s and dry. Using aseptic pro-
quality. cedures, break each egg and separate the yolk from the white
by repeatedly transfering the yolk from one half of the egg shell
The water used shall be distilled or deionized water, free from
to the other. Put the yolks into a sterile measuring cylinder and
substances that might inhibit the growth of Bacillus cereus
add four parts by volume of sterile water. Transfer aseptically
under the test conditions.
into a sterile flask (6.7) and mix vigorously.
Measurements of pH shall be made using a pH meter (6.61, set
Put the mixture in a water-bath (6.41, maintained at
at a temperature of 25 OC.
45 f 0,5 OC, for 2 h and leave for 18 to 24 h at O to 5 OC to
f
allow a precipitate to form.
If the diluent and culture media are not used immediately, they
shall, unless otherwise specified, be stored in the dark at be-
Collect the supernatant emulsion aseptically.
tween O and 5 OC for a maximum of one month, in conditions
which do not produce any change in their composition.
The emulsion may be stored at O to 5 OC for not longer than
72 h.
5.2 Diluent.
5.3.4 Complete medium (MYP agar).
See IS0 6887 and any International Standard dealing with the
product under examination.
Table 3
5.3 Agar medium. 1)
Base medium (5.3.1 )
Polymyxin B emulsion (5.3.2) 1,0 ml
5.3.1 Base medium.
Table 1
Melt the base medium and cool it in a water-bath (6.4) control-
I Component I Quantity I
led at 50 +_ 1 OC.
Beef extract
Add the other liquids, mixing well after each addition.
Peptone
o-Mannitol (C6H140,)
Sodium chloride (NaCl)
5.3.5 Preparation of agar plates for enumeration.
Phenol red (C,,H,,O,S)
Agar
Add to sterile Petri dishes (6.8) 15 to 20 ml of the complete
Water
medium (5.3.4), cooled and kept in a water-bath (6.4) at
45 f 0,5 OC, and allow to solidify.
* According to the manufacturer's instructions.
The plates may be stored prior to drying at between O and 5 OC
Dissolve the components or the complete dehydrated medium
for up to 24 h.
in the water by boiling.
Dry the plates, preferably with the lids off and the agar surface
Adjust the pH so that after sterilization it is 7,2.
downwards, in a drying cabinet, oven or incubator (6.2) at
50 f 1 OC for 30 min.
Transfer the medium in quantities of 90 ml to flasks (6.7) of ap-
propriatecapacity. Sterilizethe medium for 15min at 121 f 1 OC.
5.3.6 Preparation of agar plates for isolation.
5.3.2 Polymyxin B, emulsion.
Transfer portions of'bbout 15 ml of the base medium (5.3.11,
previously melted, cooled and kept in a water-bath (6.4) at
45 f 0,5 OC, to sterile Petri dishes (6.8) and allow to solidify.
Table 2
Immediately before use, dry the plates, preferably with the lids
Component Quantity
off and the agar surface downwards, in a drying cabinet, oven
Polymyxin B sulfate 0,100 g
or incubator (6.2) at 50 & 1 OC for 30 min.
Water 100 ml
If prepared in advance, the undried plates shall not be kept
longer than 4 h at room temperature or 1 day at between O and
Dissolve the polymyxin B sulfate in the water. Sterilize by filtra-
5 OC.
tion.
MOSSEL, D. A. A., KOOPMAN, M. J. and JONGERIUS, E. Appl. Microbiol., 1967 (Vol. 151, pp. 650-653.
1)
2
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IS0 7932 : 1987 (E)
5.6.2 Potassium hydroxide, solution.
5.4 Glucose-agar.
Table 4 7
Table
Component Quantity I Component I Quantity I
Potassium hydroxide (KOH)
Tryptone loto g
I Water
Yeast extract 15 g I
Glucose (C6H120,) loto 9
Sodium chloride (NaCl) 5,o g
Dissolve the potassium hydroxide in the water.
Bromocresol purple
0,015 g
(C2, Hl,Br2NaOzS)
5.6.3 Creatine (C4HloN30), crystals.
12 to 18 g *
Agar
Water 1 O00 ml
~~~ ~
5.7 Nitrate medium.
* According to the manufacturer's instructions.
Dissolve the components or the complete dehydrated medium
Table 8
in the water by boiling. Adjust the pH so that after sterilization
it is 7,O. Transfer the culture medium in quantities of 15 ml to Component Quantity
test tubes (6.7). Sterilize the medium for 15 min at 121 OC.
Peptone
Beef extract
Just prior to use, melt the medium in a boiling water-bath or
Potassium nitrate (KNO,)
flowing steam for 10 min, then cool rapidly to about 30 OC,
Water
keeping the tubes in a vertical position.
Dissolve the components or the complete dehydrated medium
5.5 Voges-Proskauer (VP) medium.
in the water. Adjust the pH so that after sterilization it is 7,O.
Transfer the medium to test tubes (6.7) in 5 ml quantities.
Table 5
Sterilize at 121 OC for 15 min.
Component Quantity
5.8 Nitrite reagent.
Peptone 7,O g
Glucose (C6H ,206) 5,O g
- -.
5.8.1 5-Amino-2-naphthalene sulfonic acid (5-2 ANSA),
Dipotassium hydrogenorthophosphate
solution.
5,O
I (K2HPOp) I
Sodium chloride (NaCl) 5,O CI
Table 9
Water 1 O00 ml
Component I Quantity 1
Dissolve the components or the complete dehydrated medium
5-2 ANSA (C,,H,NO,S) 61 g
in the water. Adjust the pH so that after sterilization it is 7,O.
Acetic acid (CzH,Oz), 15 % (V/ V) 100 ml
Transfer the medium to test tubes (6.7) in 5 ml quantities and
sterilize at 121 OC for 15 min.
Dissolve the 5-2 ANSA in the acetic acid and filter through
paper. 1)
5.6 Voges-Proskauer (VP) test reagents.
Store in a well-stoppered brown culture flask (preferably with a
5.6.1 a-Naphthol, solution. bulb-type dropper) between O and 5 OC.
Table 6
5.8.2 Sulfanilic acid, solution.
Component Quantity
Table 10
a-Naphthol (C,,H,O) 5,O g
I Component I Quantity I
Ethanol 96 46 ( V/ V) 100 ml
Sulfanilic acid (C6H,N03S)
I Acetic acid (C,H,O,), 15 % ( V/ V)
I
Dissolve the a-naphthol in the ethanol.
Store at between O and 5 OC in a hermetically sealed brown
Dissolve the sulfanilic acid in the acetic acid and filter through
culture flask.
paper. 1)
A suitable filter paper is Whatman No. 41 or equivalent. This information is given for the convenience of the user of this International Standard
1)
and does not constitute an endorsement of this product by ISO.
3
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IS0 7932 : 1987 (E)
Store in a well-stoppered brown culture flask (preferably with a
6.5 Loops, made of platinum-iridium or nickel-chromium
bulb-type dropper) between O and 5 OC. wire, of diameter approximately 3 mm and stab-inoculation
wires of the same material.
5.8.3 Preparation of the complete reagent.
6.6 pH meter, having an accuracy of calibration of
f 0,l pH unit at 25 OC.
Just prior to use, mix equal volumes of the two solutions 5.8.1
and 5.8.2.
6.7 Test tubes, in particular of diameter 18 mm and length
180 mm, and culture flasks') for the sterilization and conser-
Discard unused complete reagent immediately.
vation of the culture media.
NOTE - If 5-2 ANSA (5.8.1 1 is not available, it is possible to use the
reagents shown in table 11.
6.8 Petri dishes, of diameter 90 to 100 mm or, if necessary,
140 mm.
Table 11
6.9 Graduated pipettes, calibrated for bacteriological use
Component Quantity
only, of nominal capacities 10 ml and 1 ml, graduated respec-
tively in divisions of 0,5 ml and 0,l ml, and with an outflow
Solution A
opening of nominal diameter 2 to 3 mm.
Sulfanilic acid (C6H,N03S)
Acetic acid (C2H,0,), 5 mol/l 100 ml
6.10 Spreaders (hockey-stick type), made
...
IS0
NORME INTERNATIONALE 7932
Première édition
1987-1 1-01
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXQYHAPOAHAR OPiAHM3AuMR il0 CTAHAAPTMSAUMM
.____-
Microbiologie - Directives générales pour
le dénombrement de Baci//us cereus - Méthode par
comptage des colonies à 30 OC
Microbiology - General guidance for enumeration of Bacillus cereus - Colony count
technique at 30 OC
Numéro de référence
IS0 7932 : 1987 (F)
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de I'ISO). L'élaboration
des Normes internationales est normalement confiée aux comités techniques de I'ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I'ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I'ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I'ISO qui requièrent l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale IS0 7932 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
L'attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu'il s'agit, sauf indication
contraire, de la dernière édition.
@ Organisation internationale de normalisation, 1987 0
Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE IS0 7932 : 1987 (FI
Microbiologie - Directives générales pour
le dénombrement de Bacl’llus cereus - Méthode par
comptage des colonies à 30 OC
O Introduction
0.3 II apparaît que les spores de beaucoup de souches de
Bacillus cereus, sinon la plupart, germent aisément à la surface
du milieu de culture utilisé pour le dénombrement. Dans la plu-
0.1 La présente Norme internationale se propose de fournir
part des cas, il ne semble pas qu‘il y ait besoin d’un traitement
des directives générales pour l’examen microbiologique de
de choc thermique pour provoquer la germination. Parfois ce
produits alimentaires non concernés par les Normes inter-
traitement de choc thermique est souhaitable, par exemple,
nationales existant actuellement et qui devraient être prises en
pour le dénombrement des spores ou l‘inhibition de micro-
considération par les organismes élaborant des méthodes
il sera de 15 min à 70 OC.
organismes; dans ce cas,
d‘essais microbiologiques destinées à être appliquées à des
à des aliments pour animaux.
produits alimentaires ou
En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce
1 Objet et domaine d‘application
domaine d’application, il est possible que ces directives, dans
tous leurs détails, ne conviennent pas exactement à certains
La présente Norme internationale donne les directives généra-
produits et que, pour certains autres produits, il puisse être
le dénombrement de Bacillus cereus, revivifiable dans
les pour
nécessaire d’employer des méthodes différentes.
les produits destinés à la consommation humaine ou à I‘alimen-
tation animale, par comptage des colonies à 30 OC.
Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous les
efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu‘il sera possi-
ble, les directives données, et qu‘on n’aura recours à des déro-
2 Référence
gations que si cela est absolument nécessaire pour des raisons
techniques.
IS0 6887, Microbiologie - Directives générales pour la prépa-
ration des dilutions en vue de /’examen microbiologique.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il
sera tenu compte de tous les renseignements disponibles à ce
moment-là, à savoir dans quelle mesure les directives auront
3 Définition
été suivies et les raisons pour lesquelles il aura été nécessaire
d’y déroger dans le cas de produits particuliers.
Dans le cadre de la présente Norme internationale, la définition
suivante est applicable.
L‘harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immé-
diate et, pour certains groupes de produits, des Normes inter-
Bacillus cereus : Micro-organismes qui forment des colonies à
nationales et/ou des normes nationales existent peut-être déjà,
la surface d’un milieu de culture sélectif et qui donnent des
qui ne concordent pas avec ces directives. Dans le cas où des
réactions de confirmation positives quand les essais sont exé-
à contrô-
Normes internationales existent déjà pour le produit
cutés selon la méthode spécifiée dans la présente Norme inter-
ler, elles devront être appliquées, mais il serait souhaitable que,
nationale.
lorsqu‘elles viendront en révision, elles soient modifiées de
façon à se conformer à la présente Norme internationale, si bien
que, finalement, les seules divergences restantes seront celles
vraiment nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
4 Principe
4.1 Ensemencement en surface d‘un milieu sélectif solide
0.2 Pour /es besoins d’une méthode d’essai pratique, la défi-
nition de Bacillus cereus donnée au chapitre 3 et utilisée coulé dans des boîtes de Petri, avec une quantité déterminée de
comme base pour le mode opératoire, ne décrit pas d‘une l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou de la suspen-
sion mère dans le cas d’autres produits.
manière spécifique les souches de Bacillus cereus. Les essais
de confirmation notamment sont insuffisants pour distinguer
Bacillus cereus des autres bacillus proches, mais moins com- Dans les mêmes conditions, ensemencement des dilutions
décimales obtenues à partir de l’échantillon pour essai ou de la
munément rencontrés, tels que B. anthracis, B. thuringiensis,
suspension mère.
B. cereus var. mycoides, etc.
1
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IS0 7932 : 1987 (FI
il soit de 7,2.
4.2 Incubation de ces boîtes en aérobiose à 30 OC pendant 18 Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation,
à 48 h.
Répartir le milieu par quantités de 90 ml dans des flacons (6.7)
de capacité appropriée. Stériliser le milieu à 121 f 1 OC pen-
4.3 Calcul du nombre de Bacillus cereus par millilitre ou par
dant 15 min.
gramme d’échantillon, à partir du nombre de colonies caracté-
ristiques obtenues dans des boîtes choisies aux niveaux de dilu-
5.3.2 Polymyxine B, émulsion.
tion donnant un résultat significatif, et confirmées selon les
essais spécifiés.
Tableau 2
5 Diluant, milieux de culture et réactifs
Composant Quantité
Sulfate de polyrnyxine B
0,100 g
5.1 Composants de base.
Eau 100 ml
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
mandé d’utiliser, pour la préparation des milieux de culture, des Dissoudre le sulfate de polyrnyxine B dans l’eau. Stériliser par
milieux complets déshydratés, des composants de base déshy- filtration.
dratés et pour l’émulsion de jaune d’œuf une préparation com-
merciale. Les prescriptions du fabricant doivent être suivies
5.3.3 Émulsion de jaune d’œuf.
scrupuleusement.
Utiliser des œufs frais de poule, à coquille intacte. Nettoyer les
Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analyti-
œufs avec une brosse, à l’aide d’un détergent liquide, rincer à
que reconnue.
l‘eau courante, plonger dans de l’alcool à 95 % ( V/ V) pendant
30 s et sécher. En opérant de façon aseptique, casser chaque
L’eau utilisée doit être de l‘eau distillée ou déionisée, exempte
œuf et séparer les jaunes des blancs par transferts répétés du
de substances susceptibles d‘inhiber la croissance de Bacillus
jaune d’une demi coquille dans l’autre. Placer les jaunes dans
cereus dans les conditions de l’essai.
une éprouvette stérile et ajouter quatre parties en volume d’eau
stérile. Transférer de façon aseptique dans un flacon stérile
Les mesures du pH doivent être effectuées au moyen d‘un
(6.7) et mélanger vigoureusement.
pH-mètre (6.61, réglé à la température de 25 OC.
Porter le mélange au bain d’eau (6.4) réglé à 45 f 0,5 OC, pen-
Si le diluant et les milieux de culture ne sont pas utilisés extem-
dant 2 h et entreposer entre O et 5 OC pendant 18 à 24 h pour
poranément, ils doivent, sauf spécifications contraires, être
permettre au précipité de se former.
conservés à l’obscurité entre O et 5 OC, pendant un mois au
maximum dans des conditions évitant toute modification de
Recueillir aseptiquement l’émulsion surnageante.
leur composition.
L‘émulsion peut être conservée entre O et 5 OC au maximum
pendant 72 h.
5.2 Diluant.
Se reporter à I‘ISO 6887 et à la Norme internationale spécifique
5.3.4 Milieu complet.
du produit à analyser.
Tableau 3
5.3 Milieu gélosé. 1)
I Composant
5.3.1 Milieu de base.
Milieu de base (5.3.1 i rnl
90
Émulsion de polyrnyxine B (5.3.2) 1,0 rnl
Tableau 1
Émulsion de jaune d’œuf (5.3.3) 10,O ml
I Composant Quantité
____ ~~~~
Faire fondre le milieu de base puis le refroidir au bain d’eau (6.4)
Extrait de viande
à 50 f 1 OC.
réglé
Peptone
D-Mannitol ( C6H 1406)
10,o g
Ajouter les autres liquides en mélangeant soigneusement après
Chlorure de sodium (NaCl)
10,o g
chaque addition.
Rouge de phénol (CI9Hl4O3S) 0,025 g
12 à 18 g *
Agar-agar
Eau 5.3.5 Préparation des boîtes de milieu gélosé pour le
dénombrement.
*
Selon les prescriptions du fabricant.
Couler 15 à 20 ml de milieu complet (5.3.41, refroidi et maintenu
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté au bain d‘eau (6.4) à 45 * 0,5 OC dans des boîtes de Petri (6.8)
dans l’eau, en portant à l’ébullition. stériles et laisser se solidifier.
MOSSEL, D. A. A., KOOPMAN, M. J. et JONGERIUS, E. Appi. Microbiol. 15, 1967: 650-653.
1)
2
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IS0 7932 : 1987 (FI
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté
Les boîtes peuvent être conservées, avant séchage, 24 h au
dans l'eau. Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de
maximum entre O et 5 OC.
7,O. Répartir le milieu dans des tubes (6.7) par quantités de 5 ml
à 121 OC pendant 15 min.
et stériliser
Sécher les boîtes, de préférence couvercle enlevé et surface de
la gélose tournée vers le bas, dans une enceinte de séchage ou
une étuve (6.2) réglée à 50 f 1 OC pendant 30 min.
5.6 Réactifs pour la réaction de Voges-Proskauer
WP).
5.3.6 Preparation des boîtes de milieu gélosé pour
l'isolement.
5.6.1 a-Naphtol, solution.
Verser dans les boîtes de Petri (6.8) stériles environ 15 ml de
Tableau 6
milieu de base (5.3.1) fondu au préalable, puis refroidi et main-
tenu au bain d'eau (6.4) à 45 f 0,5 OC et laisser se solidifier.
I Composant I Quantité I
a-Naphtol iC,,H,O)
Immédiatement avant l'emploi, faire sécher les boîtes, de préfé-
I Alcool éthylique à 96 % ( Vi V)
I
rence ouvertes, avec la surface de la gélose orientée vers le bas
dans une enceinte de séchage ou une étuve (6.2) à une tempé-
rature de 50 f 1 OC pendant 30 min.
Dissoudre l'a-Naphtol dans l'éthanol.
0
Si elles sont préparées à l'avance, les boîtes non séchées ne Conserver entre O et 5 OC dans un flacon de verre foncé bouché
doivent pas être conservées plus de 4 h à la température hermétiquement.
ambiante ou plus d'une journée entre O et 5 OC.
5.6.2 Hydroxyde de potassium, solution.
5.4 Gélose glucosée.
Tableau 7
Tableau 4
Composant Quantité
Composant Quantité
Hydroxyde de potassium (KOH)
40,o g
Eau 100 ml
Tryptone
Extrait de levure
Glucose (C6H1206) Dissoudre l'hydroxyde de potassium dans l'eau.
Chlorure de sodium (NaCl)
Pourpre de bromocrésol
5.6.3 Créatine (C4H,oN30), en cristaux.
iCZl Hl,Br2Na02S)
Agar-agar
5.7 Milieu au nitrate.
Eau
* Selon les prescriptions du fabricant.
Tableau 8
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté
Composant Quantite
dans l'eau en portant à l'ébullition. Ajuster le pH, de sorte
Peptone
qu'après stérilisation, il soit de 7,O. Répartir le milieu de culture
Extrait de viande
par quantités de 15 ml dans des tubes (6.7). Stériliser le milieu à
Nitrate de potassium (KNO,)
121 OC pendant 15 min.
1 O00 mi
Juste avant l'emploi, faire fondre le milieu au bain d'eau bouil-
lante ou par jet de vapeur pendant 10 min. Ensuite, refroidir Dissoudre les composants ou le milieu complet dans l'eau.
rapidement à 30 OC environ en maintenant les tubes en position Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,O. Répar-
verticale. tir le milieu dans des tubes (6.7) par quantités de 5 ml. Stériliser
à 121 OC pendant 15 min.
5.5 Milieu de Voges-Proskauer (VP)
5.8 Réactif pour la recherche des nitrites.
Tableau 5
5.8.1 Acide 5-amino-2-naphtolène sulfonique
(5-2 ANSA), solution.
Composant Quantité
Peptone 7,o g
Tableau 9
Glucose i C6H1206) 5,o 9
Monohydrogénoorthophosphate de
Composant I Quantité
5,O g
potassium (K,HPO,)
5-2 ANSA (C1,H,NO,S)
Chlorure de sodium (NaCl) 5,O g 0,l g
Eau 1 O00 ml
Acide acétique (C,H,02), 15 % (V/ V) 100 ml
3
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IS0 7932 : 1987 (FI
Dissoudre le 5-2 ANSA dans l'acide acétique et filtrer sur Le matériel destiné à entrer en contact avec les milieux de cul-
papier. 1) ture, le diluant ou l'échantillon, particulièrement le matériel en
matière plastique, sauf s'il est livré stérile, doit être stérilisé par
l'une des méthodes suivantes :
Conserver dans un flacon de culture en verre foncé bien bou-
O et 5 OC.
ché (de préférence de type compte-gouttes) entre
a) au four (6.1) en le maintenant à une température com-
prise entre 170 et 175 OC durant au moins 1 h;
5.8.2 Acide sulfanilique, solution.
b) à l'autoclave (6.11, en le maintenant à une température
Tableau 10
de 121 f 1 OC durant au moins 20 min.
Composant Quantité I
6.2 Enceinte de séchage ou étuve ventilée par convection,
Acide suifanilique (C6ii7Nû3S) 0,4
pour le séchage des boîtes de gélose, réglable à 50 f 1 OC.
Acide acétique (C,H,O,), 15 % (Vl V) 100 ml
Étuve, réglable à 30 f 1 OC.
6.3
Dissoudre l'acide sulfanilique dans l'acide acétique et filtrer sur
papier. 1)
6.4 Bains d'eau, réglables à 45 It 0,5 OC et à 50 f 1 OC.
Conserver dans un flacon de culture en verre brun bien bouché
(de préférence de type compte-gouttes) entre O et 5 OC.
6.5 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-chrome,
d'environ 3 mm de diamètre et fil à ensemencer de même
5.8.3 Préparation du réactif complet.
métal.
Juste avant l'emploi, mélanger des volumes égaux des deux
6.6 pH-mètre, ayant une précision de réglage de f 0,l
solutions 5.8.1 et 5.8.2.
unité de pH à 25 OC.
Ne pas utiliser le réactif restant.
6.7 Tubes à essai, notamment de 18 mm de diamètre et
180 mm de longueur, et flacons de culture2) pour la stérilisa-
NOTE - Si le 5-2 ANSA (5.8.1) n'est pas disponible, il est possible
tion et la conservation des milieux de culture.
d'utiliser les réactifs
...
Questions, Comments and Discussion
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