ISO 7251:1993
(Main)Microbiology — General guidance for enumeration of presumptive Escherichia coli — Most probable number technique
Microbiology — General guidance for enumeration of presumptive Escherichia coli — Most probable number technique
Gives general guidelines for the enumeration of presumptive Escherichia coli in products intended for human consumption or feeding of animals, by means of the liquid-medium culture technique and calculation of the most probable number after incubation at 35 °C or 37 °C (this temperature forming the subject of agreement between the parties concerned), then incubation at 45 °C. A limitation of the applicability is imposed by the susceptibility of the method to a large degree of variability.
Microbiologie — Directives générales pour le dénombrement d'Escherichia coli présumés — Technique du nombre le plus probable
La présente Norme internationale donne des directives générales pour le dénombrement d'Escherichia coli présumés dans les produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale, au moyen de la technique de culture en milieu liquide avec calcul du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 35 °C ou 37 °C (cette température faisant l'objet d'un accord entre les parties concernées), puis à 45 °C. IMPORTANT -- Il existe des espèces d'Escherichia coli pathogènes qui ne se cultivent pas à 45 °C. Des limites sont imposées aux possibilités d'application de la présente Norme internationale, du fait que cette méthode est sujette à de grandes variations. Il est recommandé d'appliquer cette méthode et d'interpréter les résultats à la lumière des renseignements donnés en 10.4.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
ISO
STANDARD
7251
Second edition
1993-12-15
Microbiology - General guidance for
enumeration of presumptive Escherichia
.
col1 - Most probable number technique
Microbiologie - Directives g&&ales pour Ie dbnombrement
d’Escherichia coli pr&um& - Technique du nombre Ie plus probable
Reference number
ISO 7251 :1993(E)
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ISO 7251:1993(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International’standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 7251 was prepared by Technical Committee
lSO/lC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 9,
Microbiology.
This second edition cancels and replaces the first edition
(ISO 7251:1984), which has been technically revised.
Annex A forms an integral patt of this International Standard.
0 ISO 1993
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form or
by any means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without per-
mission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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ISO 7251:1993(E)
Introduction
This International Standard is intended to provide general guidance for the
examination of products not dealt with by existing International Standards
and to be taken into account by organizations preparing microbiological
methods of test for application to foods or to animal feeding stuffs. Be-
cause of the large variety of products within this field of application, these
guidelines may not be appropriate in every detail for certain products, and
for some other products it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to
apply the provided guidelines as far as possible and that deviations from
them will only be made if absolutely necessaty for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which the guide-
lines have been followed and the reasons for deviations from them in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain
groups of products International Standards and/or national Standards may
already exist that do not comply with these guidelines. In cases where
International Standards already exist for the product to be tested, they
should be followed, but it is hoped that when such Standards are reviewed
they will be changed to comply with this International Standard so that
eventually the only remaining departures from these guidelines will be
those necessary for weil-established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 7251:1993(E)
Microbiology - General guidance for enu.meration of
presumptive Escherichia col; - Most probable number
technique
3 Definition
1 Scope
.
This International Standard gives general guidelines For the purposes of this International Standard, the
for the enumeration of presumptive Escherichia coli following definition applies.
in products intended for human consumption or
feeding of animals, by means of the liquid-medium
3.1 presumptive Escherichia coli: Bacteria which,
culture technique and calculation of the most probable at 45 “C, Cause fermentation of lactose with the pro-
number (MPN) after incubation at 35 “C or 37 “C (this
duction of gas, and which, at 45 “C, produce indole
temperature forming the subject of agreement be-
from tryptophan, when the test is carried out in ac-
tween the Parties concerned), then incubation at cordante with the method specified in this Inter-
45 “C.
national Standard.
CAUTION - Some Escherichia coli pathogenic
species do not grow at 45 OC. 4 Principle
A limitation of the applicability of this International
4.1 Inoculation of three tubes of double-strength
Standard is imposed by the susceptibility of the
liquid selective enrichment medium C5.3.1 a)]l) with a
method to a large degree of variability. The method
specified quantity of the test Sample if the initial
should be applied and the results interpreted in the
product is liquid, or with a specified quantity of the
light of the information given in 10.4.
initial Suspension in the case of other products.
4.2 Inoculation of three tubes of Single-strength liq-
2 Normative references
uid enrichment medium C5.3.1 b)]l) with a specified
quantity of test Sample if the initial product is liquid,
The following Standards contain provisions which,
or with a specified quantity of the initial Suspension in
through reference in this text, constitute provisions
the case of other products.
of this International Standard. At the time of publi-
cation, the editions indicated were valid. All Standards
Then, under the same conditions, inoculation of the
are subject to revision, and Parties to agreements
medium C5.3.1 b)] with decimal dilutions of the test
based on this International Standard are encouraged
Sample or of the initial Suspension.
to investigate the possibility of applying the most re-
cent editions of the Standards indicated below.
4.3 Incubation of the tubes of double- and single-
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
strength medium at 35 “C or 37 “C (as agreed) for
rently valid International Standards.
24 h to 48 h. Examination of the tubes for gas forT
mation.
ISO 6887: 1983, Microbiology - General guidance for
the preparation of dilutions for microbiological exam-
ina tion.
4.4 Inoculation, from the tubes of double- and
Single-strength medium which have given rise to gas
ISO 72 18: 1985, MicrobioIogy - General guidance for
formation, of a new series of tubes containing a liquid
microbiological examina tions.
selective medium.
1) if necessary, another liquid enrichment medium may be used Prior to inoculation of the selective medium.
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ISO 7251:1993(E)
4.5 Incubation at 45 “C for 24 h to 48 h, and exam- 5.3.2 Preparation
ination of the new series of tubes (4.4) for gas for-
mation. Dissolve the components or the dehydrated complete
medium in the water, by heating if necessary.
Inoculation, from the tubes of selective medium
4.6
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
which have given rise to gas formation, of a new se-
it is 6,8 at 25 “C.
ries of tubes containing tryptone water.
Dispense the media in quantities of 10 ‘ml into tubes
of dimensions 16 mm x 160 mm (6.4) containing
4.7 Incubation at 45 “C for 24 h to 48 h, and exam-
Durharn tubes (6.6) in the case of Single-strength
ination of the new series of tubes (4.6) for indole
medium, and into test tubes of dimensions
production.
20 mm x 200 mm (6.4) containing Durharn tubes
(6.6) in t Ie case of the double-strength medium.
4.8 Determination of the most probable number of
Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at
presumptive Escherichia coli by means of an MPN
121 “C.
table (see annex A), according to the number of in-
cubated tubes which gave rise to gas formation in the
The Dur iarn tubes shall not contain air bubbles after
selective medium and in which indole was produced
sterilizat ion,
in the tryptone water.
5.4 EC Broth (second selective medium)
5 Diktion fluid, culture media and
reagent
5.4.1 Composition
5.1 General
For current laboratoty practice, see ISO 7218.
mo g
Tryptose or trypticase
5,O g
Lactose
5.2 Diktion fluid
Bile salts No. 31) 1,5 g
See ISO 6887:1983, clause 5, and the specific Inter-
Dipotassium hydrogen Phosphate
national Standard dealing with the product under 410 g
K2HP0,)
examination.
Potassium dihydrogen Phosphate
115 g
(KH,PO,)
5.3 Lauryl sulfate tryptose broth (selective
Sodium chloride 5,O g
enrichment medium).
1 000 ml
Water
5.3.1 Composition
1) See ICMSF Mcroorganisms in Foods 7, 2nd edition,
32, p. 280, University of Toronto Press, Canada.
a) b)
Double- Single-
strength strength
5.4.2 Preparation
medium medium
Tryptose
40,O g wo g
Dissolve the components or the dehydrated complete
medium in the water, by heating if necessary.
Lactose IO,0 g 5,O g
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
Dipotassium hydrogen phos-
5,5 9 23 g
it is 6,8 at 25 “C.
phate (K,HPO,)
Potassium dihydrogen phos-
Dispense the medium in quantities of 10 ml into
5,5 g Z75 g
phate (KH,PO,)
tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.4) contain-
ing Durharn tubes (6.6).
Sodium chloride
IO,0 g 5,O g
Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at
Sodium lauryl sulfate
02 g O,l g
121 “C.
[CH&CH,), 1 OSO,Na]
Water 1 000 ml 1 000 ml The Durharn tubes shall not contain air bubbles after
sterilization.
/
2
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ISO 7251:1993(E)
6.2 Incubator, capable of operating at 35 “C + 1 “C
5.5 Tryptone water
or 37 “C + 1 “C, depending on the temp&ature
adopted.
5.5.1 Composition
6.3 Water bath, capable of being maintained at
Tryptone
IO,0 g 45 “C $- 0,5 “C (to allow the inoculated tubes to be
maintained at this temperature).
Sodium chloride
510 g
Water 1 000 ml
6.4 Test tubes, of dimensions approximately
16 mm x 160 mm and 20 mm x 200 mm.
5.5.2 Preparation
6.5 Loop, made of platinum/iridium or
nickel/chromium, approximately 3 mm in diameter, or
Dissolve the components in the water, by heating if
sterile disposable bags.
necessary.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
6.6 Durharn tubes, of a size suitable for use in the
it is 7,3 at 25 “C.
test tubes (6.4).
Dispense the medium in quantities of 5 ml to 10 ml
into tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.4).
6.7 Total-delivery pipettes, having nominal ca-
pacities of 1 ml and 10 ml.
Sterilize for 15 min in an autoclave (6.1) set at
121 “C.
6.8 pH-meter, accurate to within & 0,l pH units at
5.6 Indole reagent (Kovacs reagent) 25 “C.
5.6.1 Composition
7 Sampling
lt is important that the laboratory receive a Sample
4-Dimethylaminobenzaldehyde
510 g
which is truly representative and has not been’ dam-
2-Methylbutan-1-01 or Pentan-1 -01 75,0 ml
aged or changed during transport or storage. Sam-
pling is not part of the method specified in this
Hydrochlorit acid (pZO 1 ,18 to 1,19 g/ml ) 25,0 ml
International Standard. If there is no specific Inter-
national Standard dealing with sampling of the product
concerned, it is recommended that the Parties co
...
NORME ISO
7251
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1993-12-15
Microbiologie - Directives générales pour
le dénombrement d’Escherichia coli
- Technique du nombre le plus
présumés
probable
- General guidance for enumeration of presumptive
Microbiology
- Most probable number technique
Escherichia coli
Numéro de référence
KO 7251:1993(F)
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ISO 7251:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fedération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique cree à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comites techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mites membres votants.
La Norme internationale ISO 7251 a ete elaboree par le comité technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette deuxieme edition annule et remplace la première édition
(ISO 7251:1984), qui a été revisée techniquement.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
0 SO 1993
Droits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord Acrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
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ISO 7251:1993(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernes par les Normes
internationales existant actuellement, et pour être prises en considération
par les organismes élaborant des methodes d’essais microbiologiques
destinées à être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments
pour animaux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans
ce domaine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement à certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des metho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, les
directives données, et qu’on aura recours a des dérogations que si cela
est absolument necessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront ete suivies et les raisons pour
lesquelles il aura ete necessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des methodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
normes nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec ces
directives. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà pour
le produit à contrôler, elles devront être appliquées, mais il serait souhai-
table que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient modifiees de fa-
çon à se conformer à la présente Norme internationale, si bien que
finalement les seules divergences restantes seront celles nécessaires
pour des raisons techniques bien etablies.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
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NORME INTERNATIONALE ISO 7251:1993(F)
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement d’Escherichia cd; présumés -
Technique du nombre le plus probable
quer les Aditions les plus récentes des normes
1 Domaine d’application
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possédent le registre des Normes internationales en
La présente Norme internationale donne des directi-
vigueur à un moment donne.
ves générales pour le denombrement d’Fccherichia
co/i présumes dans les produits destines a la
I SO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
consommation humaine ou à l’alimentation animale,
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
au moyen de la technique de culture en milieu liquide
microbiologique.
avec calcul du nombre le plus probable (NPP) aprés
incubation à 35 “C ou 37 “C (cette température faisant
ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
l’objet d’un accord entre les parties concernées), puis
pour les examens microbiologiques.
à 45 “C.
IMPORTANT - II existe des espèces d’Escherichia
3 Définition
CO/I’ pathogènes qui ne se cultivent pas à 45 OC.
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
Des limites sont imposées aux possibilités d’applica-
la définition suivante s’applique.
tion de la présente Norme internationale, du fait que
cette methode est sujette à de grandes variations. II
3.1 Escherichia coli présumés: Bactéries qui, a
est recommande d’appliquer cette méthode et d’in-
45 “C, fermentent le lactose avec production de gaz
terpréter les resultats à la lumiére .des rensei-
et qui, à 45 OC, produisent de I’indole a partir du
gnements donnes en 10.4.
tryptophane, lorsque l’essai est effectue selon la mé-
thode spécifiée dans la présente Norme internatio-
nale.
2 Références normatives
-
4 Principe
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la réference qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente 4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu liquide
Norme internationale. Au moment de la publication, concentration [voir
d’enrichissement double
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
5.3.1 a)]l) avec une quantité déterminee de I’échan-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
tillon pour essai si le produit a examiner est liquide,
des accords fondes sur la présente Norme internatio-
ou avec une quantité déterminee de suspension mere
nale sont invitees à rechercher la possibilité d’appli- dans le cas d’autres produits.
1) Si nécessaire, un autre milieu liquide d’enrichissement peut être utilisé avant l’ensemencement du milieu sélectif.
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ISO 7251:1993(F)
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu liquide
5.3 Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate (mi-
d’enrichissement simple concentration [voir
lieu d’enrichissement sélectif).
5.3.1 b)]l) avec une quantité determinée de I’échan-
tillon pour essai si le produit a examiner est liquide,
ou avec une quantité determinee de suspension mère
dans le cas d’autres produits.
Puis dans les mêmes conditions, ensemencement du
5.3.1 Composition
milieu C5.3.1 b)] avec les dilutions decimales de
l’échantillon pour essai ou de la suspension mere.
4.3 Incubation des tubes de milieu double et simple
concentration à 35 “C ou 37 “C (selon accord) durant
a) b)
24 h a 48 h. Examen des tubes pour la formation de
Milieu Milieu
.
gaz
double simple
concen- concen-
tration tration
4.4 Ensemencement, a partir des tubes de milieu
Tryptose 4w g mo g
double et simple concentration ayant donne lieu à un
dégagement gazeux, d’une nouvelle série de tubes
Lactose mo 9 510 g
contenant un milieu selectif liquide.
Hydrogénophosphate
5,5 g 23 g
dipotassique (K,HPO,)
4.5 Incubation à 45 “C durant 24 h à 48 h et examen
Dihydrogénophosphate de
2,75 g
5,5 g
de cette nouvelle série de tubes (4.4) pour la for-
potassium (KH,PO,)
mation de gaz.
Chlorure de sodium 5,o g
lOtO g
Lauryl sulfate de sodium
02 g ai g
4.6 Ensemencement, a partir des tubes contenant
[CH&CH,), ,OSO,Na]
le milieu selectif ayant donne lieu a un dégagement
Eau 1 000 ml 1 000 ml
gazeux, d’une nouvelle série de tubes contenant de
l’eau tfyptonée.
4.7 Incubation à 45 “C durant 24 h à 48 h et examen
de cette nouvelle serie de tubes (4.6) pour la produc-
tion d’indole.
5.3.2 Préparation
4.8 Détermination du nombre le plus probable
d’kcherichia coliprésumés au moyen de la table NPP
(voir annexe A), d’après le nombre de tubes incubes
ou le m ilieu complet dés-
Dissoud re les composants
pour lesquels il y a eu formation de gaz dans le milieu
necessaire.
hydrate, dans l’eau, en cha uffant si
sélectif, et production d’indole dans l’eau ttyptonée.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après sterili-
sation, il soit de 6,8 à 25 “C.
5 Diluant, milieux de culture et réactif
Repartir les milieux, par quantités de 10 ml dans des
tubes de 16 mm x 160 mm (6.4) contenant des clo-
ches de Durham (6.6) dans le cas du milieu simple
concentration, et dans des tubes de
5.1 Généralités
20 mm x 200 mm (6.4) contenant des cloches de
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir
Durham (6.6) dans le cas du milieu double concen-
I’ISO 7218.
tration.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé a 121 “C pendant
15 min.
5.2 Diluant
Voir ISO 6887:1983, chapitre 5, et la Norme interna- Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de
tionale spécifique du produit à examiner. bulles d’air aprés stérilisation.
2
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ISO 7251:1993(F)
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
5.4 Bouillon EC (deuxiéme milieu sélectif)
15 min.
5.4.1 Composition
5.6 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif
de Kovacs)
Tryptose ou trypticase
2w g
5.6.1 Composition
Lactose
5,O g
Sels biliaires no 31)
l,5 g
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
5,O g
Hydrogénophosphate dipotassique
40 g
Méthyl-2 butanol-l ou pentanol-1 75,0 ml
K,HPO,)
Dihydrogénophosphate de potassium Acide chlorhydrique (pzO 1 ,18 à 1 ,19 g/mI ) 25,0 ml
115 g
KH2P04)
Chlorure de sodium
5,O g
5.6.2 Préparation
Eau 1 000 ml
Dissoudre le diméthylamino-4-benzaldéhyde dans I’al-
cool en chauffant doucement au moyen d’un bain
1) Voir ICMSF Microorganisms in Foocis 7, 2nd edition,
d’eau réglable à environ 50 “C à 55 OC.
32, p. 280, University of Toronto Press, Canada.
Refroidir et ajouter l’acide.
5.4.2 Préparation
Mettre à l’abri de la lumière et conserver à 4 “C.
Dissoudre les composants ou le milieu complet des- Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair.
hydrate dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
6 Appareillage et verrerie
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après sterili-
sation, il soit de 6,8 à 25 “C.
NOTE 1 Le matériel à usage unique est acceptable au
meme titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications
Repartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des
sont similaires.
tubes de 16 mm x 160 mm (6.4) contenant des clo-
ches de Durham (6.6).
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et,
Steriliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
en particulier, ce qui suit.
15 min.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sè-
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de
che (four) ou en chaleur humide (autoclave)
bulles d’air après sterilisation.
Voir I’ISO 7218.
5.5 Eau tryptonée
6.2 Étuve, réglable à 35 “C If: 1 “C ou à
37 OC + 1 OC, selon la température retenue.
5.5.1 Composition -
6.3 Bain d’eau, réglable à 45 “C + 0,5 “C (permet-
Tryptone
lao g tant de maintenir les tubes ensemences à cette tem-
pérature).
Chlorure de sodium
510 g
Eau 1 000 ml 6.4 Tubes à essais, de 16mmx160mm et
20 mm x 200 mm environ.
5.5.2 Preparation 6.5 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-
chrome, d’environ 3 mm de diamètre, ou sacs je-
chauf tables stériles.
Dissoudre les composants dans l’eau, en fant si
necessaire.
6.6 Cloches de Durham, de dimensions appro-
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés sterili-
priées en vue de leur utilisation dans les tubes (6.4).
sation, il soit de 7,3 a 25 OC.
Repartir le milieu, par quantités de 5 ml à 10 ml, dans 6.7 Pipettes ti écoulement total, de 1 ml et 10 ml
des tubes de 16 mm x 160 mm (6.4). de capacité nominale
3
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ISO 7251:1993(F)
9.2.2 Incubation
6.8 pH-mètre, précis à + 0,l unité de pH a 25 “C.
Incuber les tubes de milieu sélectif double concen-
7 Échantillonnage
tration (9.2.1 .l) et les tubes de milieu sélectif simple
concentration (9.2.1.2 et 9.2.1.3) à l’étuve (6.2) réglée
II est important que le laboratoire reçoive un échan- à 35 “C ou 37 “C (selon accord) durant 24 h + 2 h. Si,
tillon reellement représentatif, non endommage ou à ce stade, on n’observe pas de formation de gaz ni
modifie lors du transport et de l’entreposage. S’il de trouble empêchant l’observation du dégagement
n’exis
...
NORME ISO
7251
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1993-12-15
Microbiologie - Directives générales pour
le dénombrement d’Escherichia coli
- Technique du nombre le plus
présumés
probable
- General guidance for enumeration of presumptive
Microbiology
- Most probable number technique
Escherichia coli
Numéro de référence
KO 7251:1993(F)
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ISO 7251:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fedération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique cree à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comites techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mites membres votants.
La Norme internationale ISO 7251 a ete elaboree par le comité technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette deuxieme edition annule et remplace la première édition
(ISO 7251:1984), qui a été revisée techniquement.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
0 SO 1993
Droits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord Acrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
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ISO 7251:1993(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernes par les Normes
internationales existant actuellement, et pour être prises en considération
par les organismes élaborant des methodes d’essais microbiologiques
destinées à être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments
pour animaux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans
ce domaine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement à certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des metho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, les
directives données, et qu’on aura recours a des dérogations que si cela
est absolument necessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront ete suivies et les raisons pour
lesquelles il aura ete necessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des methodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
normes nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec ces
directives. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà pour
le produit à contrôler, elles devront être appliquées, mais il serait souhai-
table que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient modifiees de fa-
çon à se conformer à la présente Norme internationale, si bien que
finalement les seules divergences restantes seront celles nécessaires
pour des raisons techniques bien etablies.
. . .
III
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Page blanche
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NORME INTERNATIONALE ISO 7251:1993(F)
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement d’Escherichia cd; présumés -
Technique du nombre le plus probable
quer les Aditions les plus récentes des normes
1 Domaine d’application
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possédent le registre des Normes internationales en
La présente Norme internationale donne des directi-
vigueur à un moment donne.
ves générales pour le denombrement d’Fccherichia
co/i présumes dans les produits destines a la
I SO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
consommation humaine ou à l’alimentation animale,
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
au moyen de la technique de culture en milieu liquide
microbiologique.
avec calcul du nombre le plus probable (NPP) aprés
incubation à 35 “C ou 37 “C (cette température faisant
ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
l’objet d’un accord entre les parties concernées), puis
pour les examens microbiologiques.
à 45 “C.
IMPORTANT - II existe des espèces d’Escherichia
3 Définition
CO/I’ pathogènes qui ne se cultivent pas à 45 OC.
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
Des limites sont imposées aux possibilités d’applica-
la définition suivante s’applique.
tion de la présente Norme internationale, du fait que
cette methode est sujette à de grandes variations. II
3.1 Escherichia coli présumés: Bactéries qui, a
est recommande d’appliquer cette méthode et d’in-
45 “C, fermentent le lactose avec production de gaz
terpréter les resultats à la lumiére .des rensei-
et qui, à 45 OC, produisent de I’indole a partir du
gnements donnes en 10.4.
tryptophane, lorsque l’essai est effectue selon la mé-
thode spécifiée dans la présente Norme internatio-
nale.
2 Références normatives
-
4 Principe
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la réference qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente 4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu liquide
Norme internationale. Au moment de la publication, concentration [voir
d’enrichissement double
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
5.3.1 a)]l) avec une quantité déterminee de I’échan-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
tillon pour essai si le produit a examiner est liquide,
des accords fondes sur la présente Norme internatio-
ou avec une quantité déterminee de suspension mere
nale sont invitees à rechercher la possibilité d’appli- dans le cas d’autres produits.
1) Si nécessaire, un autre milieu liquide d’enrichissement peut être utilisé avant l’ensemencement du milieu sélectif.
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ISO 7251:1993(F)
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu liquide
5.3 Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate (mi-
d’enrichissement simple concentration [voir
lieu d’enrichissement sélectif).
5.3.1 b)]l) avec une quantité determinée de I’échan-
tillon pour essai si le produit a examiner est liquide,
ou avec une quantité determinee de suspension mère
dans le cas d’autres produits.
Puis dans les mêmes conditions, ensemencement du
5.3.1 Composition
milieu C5.3.1 b)] avec les dilutions decimales de
l’échantillon pour essai ou de la suspension mere.
4.3 Incubation des tubes de milieu double et simple
concentration à 35 “C ou 37 “C (selon accord) durant
a) b)
24 h a 48 h. Examen des tubes pour la formation de
Milieu Milieu
.
gaz
double simple
concen- concen-
tration tration
4.4 Ensemencement, a partir des tubes de milieu
Tryptose 4w g mo g
double et simple concentration ayant donne lieu à un
dégagement gazeux, d’une nouvelle série de tubes
Lactose mo 9 510 g
contenant un milieu selectif liquide.
Hydrogénophosphate
5,5 g 23 g
dipotassique (K,HPO,)
4.5 Incubation à 45 “C durant 24 h à 48 h et examen
Dihydrogénophosphate de
2,75 g
5,5 g
de cette nouvelle série de tubes (4.4) pour la for-
potassium (KH,PO,)
mation de gaz.
Chlorure de sodium 5,o g
lOtO g
Lauryl sulfate de sodium
02 g ai g
4.6 Ensemencement, a partir des tubes contenant
[CH&CH,), ,OSO,Na]
le milieu selectif ayant donne lieu a un dégagement
Eau 1 000 ml 1 000 ml
gazeux, d’une nouvelle série de tubes contenant de
l’eau tfyptonée.
4.7 Incubation à 45 “C durant 24 h à 48 h et examen
de cette nouvelle serie de tubes (4.6) pour la produc-
tion d’indole.
5.3.2 Préparation
4.8 Détermination du nombre le plus probable
d’kcherichia coliprésumés au moyen de la table NPP
(voir annexe A), d’après le nombre de tubes incubes
ou le m ilieu complet dés-
Dissoud re les composants
pour lesquels il y a eu formation de gaz dans le milieu
necessaire.
hydrate, dans l’eau, en cha uffant si
sélectif, et production d’indole dans l’eau ttyptonée.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après sterili-
sation, il soit de 6,8 à 25 “C.
5 Diluant, milieux de culture et réactif
Repartir les milieux, par quantités de 10 ml dans des
tubes de 16 mm x 160 mm (6.4) contenant des clo-
ches de Durham (6.6) dans le cas du milieu simple
concentration, et dans des tubes de
5.1 Généralités
20 mm x 200 mm (6.4) contenant des cloches de
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir
Durham (6.6) dans le cas du milieu double concen-
I’ISO 7218.
tration.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé a 121 “C pendant
15 min.
5.2 Diluant
Voir ISO 6887:1983, chapitre 5, et la Norme interna- Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de
tionale spécifique du produit à examiner. bulles d’air aprés stérilisation.
2
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ISO 7251:1993(F)
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
5.4 Bouillon EC (deuxiéme milieu sélectif)
15 min.
5.4.1 Composition
5.6 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif
de Kovacs)
Tryptose ou trypticase
2w g
5.6.1 Composition
Lactose
5,O g
Sels biliaires no 31)
l,5 g
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
5,O g
Hydrogénophosphate dipotassique
40 g
Méthyl-2 butanol-l ou pentanol-1 75,0 ml
K,HPO,)
Dihydrogénophosphate de potassium Acide chlorhydrique (pzO 1 ,18 à 1 ,19 g/mI ) 25,0 ml
115 g
KH2P04)
Chlorure de sodium
5,O g
5.6.2 Préparation
Eau 1 000 ml
Dissoudre le diméthylamino-4-benzaldéhyde dans I’al-
cool en chauffant doucement au moyen d’un bain
1) Voir ICMSF Microorganisms in Foocis 7, 2nd edition,
d’eau réglable à environ 50 “C à 55 OC.
32, p. 280, University of Toronto Press, Canada.
Refroidir et ajouter l’acide.
5.4.2 Préparation
Mettre à l’abri de la lumière et conserver à 4 “C.
Dissoudre les composants ou le milieu complet des- Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair.
hydrate dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
6 Appareillage et verrerie
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après sterili-
sation, il soit de 6,8 à 25 “C.
NOTE 1 Le matériel à usage unique est acceptable au
meme titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications
Repartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des
sont similaires.
tubes de 16 mm x 160 mm (6.4) contenant des clo-
ches de Durham (6.6).
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et,
Steriliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant
en particulier, ce qui suit.
15 min.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sè-
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de
che (four) ou en chaleur humide (autoclave)
bulles d’air après sterilisation.
Voir I’ISO 7218.
5.5 Eau tryptonée
6.2 Étuve, réglable à 35 “C If: 1 “C ou à
37 OC + 1 OC, selon la température retenue.
5.5.1 Composition -
6.3 Bain d’eau, réglable à 45 “C + 0,5 “C (permet-
Tryptone
lao g tant de maintenir les tubes ensemences à cette tem-
pérature).
Chlorure de sodium
510 g
Eau 1 000 ml 6.4 Tubes à essais, de 16mmx160mm et
20 mm x 200 mm environ.
5.5.2 Preparation 6.5 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-
chrome, d’environ 3 mm de diamètre, ou sacs je-
chauf tables stériles.
Dissoudre les composants dans l’eau, en fant si
necessaire.
6.6 Cloches de Durham, de dimensions appro-
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés sterili-
priées en vue de leur utilisation dans les tubes (6.4).
sation, il soit de 7,3 a 25 OC.
Repartir le milieu, par quantités de 5 ml à 10 ml, dans 6.7 Pipettes ti écoulement total, de 1 ml et 10 ml
des tubes de 16 mm x 160 mm (6.4). de capacité nominale
3
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ISO 7251:1993(F)
9.2.2 Incubation
6.8 pH-mètre, précis à + 0,l unité de pH a 25 “C.
Incuber les tubes de milieu sélectif double concen-
7 Échantillonnage
tration (9.2.1 .l) et les tubes de milieu sélectif simple
concentration (9.2.1.2 et 9.2.1.3) à l’étuve (6.2) réglée
II est important que le laboratoire reçoive un échan- à 35 “C ou 37 “C (selon accord) durant 24 h + 2 h. Si,
tillon reellement représentatif, non endommage ou à ce stade, on n’observe pas de formation de gaz ni
modifie lors du transport et de l’entreposage. S’il de trouble empêchant l’observation du dégagement
n’exis
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.