ISO 7218:1985
(Main)Microbiology — General guidance for microbiological examinations
Microbiology — General guidance for microbiological examinations
Microbiologie — Directives générales pour les examens microbiologiques
General Information
Relations
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I
International Standard @ 721%
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANOARDIZATION*MEXAYHAPOflHAR OPrAHHJAUMR no CTAHRAPTM3AUMM*ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMAI ISATION
Microbiology - General guidance for microbiological
e
exa m i nations
Microbiologie - Directives générales pour les examens rnicrobiologiques
First edition - 1985-09-01
w UDC R9.678 Ref. No. IS0 7218-1985 (E)
-
Descriptors : microbiological analysis, micro-organisms, sampling, food products.
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40
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O
2 Price based on 14 pages
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Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through IS0 technical committees. Each member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the IS0 Council. They are approved in accordance with IS0 procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard IS0 7218 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products.
0 international Organization for Standardization, 1985 O
Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD IS0 7218-1985 (E)
Microbiology - General guidance for microbiological
exam i nations
The purpose of this International Standard is to help ensure the
O Introduction
validity of examinations, to ensure that general techniques
When performing microbiological examinations, it is especially
used for carrying out the examinations are the same in all
important laboratories and to contribute to the protection of the health of
laboratory personnel by avoiding risks of infection.
a) that only the micro-organisms which are present in the
samples are isolated or enumerated ;
b) that the micro-organisms do not contaminate the en- 2 Reference
vironment.
IS0 6887, Microbiology - General guidance for the prep-
In order to achieve this, it is necessary to pay attention to per- aration of dilutions for microbiological examination.
sonal hygiene and to use working techniques that ensure, as far
as possible, aseptic conditions.
3 Personal hygiene
Since, in this International Standard, it is possible to give only a
few examples of the precautions to be taken during micro-
From the point of view of personal hygiene, the following
biological examinations, a thorough knowledge of microbio-
precautions need to be taken to prevent contamination of
logical examinations and of the micro-organisms involved is
samples and culture media in particular, but also to avoid risks
essential.
of infection to laboratory personnel :
Ultimately, it is the analyst who should judge whether manipu-
- Strictly observe the usual hygienic precautions. Keep
lations are safe and can be considered to be good laboratory
nails short. Wear hair and beard protection when necessary.
practice.
- Wash hands thoroughly with warm water and liquid or
powdered soap before and after microbiological exami-
Many manipulations may, for instance, unintentionally lead to
nations and also immediately after each use of toilets. Use
cross-contamination and the analyst should always verify the
disposable single-use paper or cloth towels.
accuracy of the results given by his technique.
- Wear clean laboratory clothing, without holes or tears.
In order to be able to perform examinations correctly, it is
This clothing shall not be worn elsewhere.
necessary to take certain precautions when constructing and
- Do not eat, drink or smoke in microbiological labora-
equipping a laboratory. A number of such precautions are
tories.
referred to in clause 4.
- Do not speak, cough, etc. during inoculation of plates
Certain precautions have to be taken not only for the sake of
and tubes.
hygiene but also to ensure good reproducibility of results. It is
- Do not allow personnel with serious infections of the
not possible to specify all precautions to be taken in all cir-
cumstances, but the principal measures to be taken during the hands or face to carry out microbiological examinations
when there is a possibility that this could lead to contami-
preparation, sterilization and storage of media and apparatus
nation.
are described in clause 5.
If the guidance given in this International Standard is observed,
this will also contribute to the protection of the health of per- 4 Installations and equipment
sonnel. For further information on this subject, reference
should be made to the documentation listed in the bibli-
4.1 Work areas
ography, and in particular to references [Il, i21 and i31.
4.1.1 There shall be sufficient room to ensure that work areas
can be kept clean and orderly.
1 Scope and field of application
Approximately 20 m2 of work area should be provided for each
This International Standard gives general instructions for carry-
analyst, including auxiliary rooms (for special work such as
ing out microbiological examinations in accordance with
weighing, centrifuging, incubation and refrigeration).
specific standards.
1
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IS0 7218-1985 (E)
once per month for example. Check the count of micro-
4.1.2 Special rooms shall be provided for
organisms in the air at frequent intervals by means of special
a) cleaning glassware and other utensils, and, if possible, equipment for the sampling and examination of air.
sterilization of used glassware and incubated culture media ;
b) preparation and sterilization of media ;
4.1.6 Working places shall be protected against direct
sunlight.
c) checking the sterility of foodstuffs in cases where a
laminar flow hood is not used.
4.1.7 Ensure that work benches and apparatus remain in
4.1.3 A separate room shall be provided for the preparation of good repair (for example cracks in work benches can trap dirt
samples if there is a risk of cross-contamination, for example and hence constitute a source of contamination).
for powdered products containing a high number of micro-
organisms (especially in the case of raw materials).
4.1.8 Rooms shall be well lit: at least 500 Ix at 1 m from the
floor and 1 200 Ix ("artificial daylight") on work benches.
For the determination of pathogenic micro-organisms, for
example Salmonella, it is strongly advised to provide a separate
room, or at least to provide a cabinet for that purpose, to avoid
4.2 Incubators (cabinets. rooms1
not only cross-contamination but also infection of personnel.
Use special air incubators or water-baths when the temperature
4.1.4 When installing a laboratory, measures should be taken
has to be constant and accurate to within a few tenths of a
to reduce the risks of contamination by dust, and hence micro-
degree.
organisms, for example
a) cupboards that reach the ceiling;
4.2.1 Incubators shall be well insulated and properly equipped
with heating units and large incubators shall have forced air cir-
b) tables, window-ledges, refrigerators, ovens, inocu-
culation, so that the temperature everywhere is correct to the
lation cabinets installed in such a way that there are no dust-
nearest 1 OC.
traps and that they are easy to clean (to facilitate cleaning,
movable equipment may be used);
4.2.2 The ambient temperature shall always be lower than
c) windows and doors that close tightly (in order to avoid
air draughts) ; that of the incubator, or the latter shall have a cooling system.
d) window blinds, etc., installed on the outside;
4.2.3 The temperature shall be checked at least every working
e) closed cupboards for storage of documents used during
day.
analyses, and of samples, media, reagents, etc. ;
NOTE - Periodicals and books etc. which are not frequently used For this purpose, each incubator shall contain at least one ther-
should be kept in a special room (an office for examplel outside the mometer, the bulb of which is submerged in glycerol contained
room used for analysis.
in a closed flask, and a maximum and minimum thermometer.
Large cabinets and incubating rooms shall be equipped with
f) walls, ceilings, floors and furniture with smooth sur-
several thermometers and maximum and minimum ther-
faces, easy to clean and, if necessary, to disinfect, and with
mometers, suitably distributed.
curved joins between walls and ceilings, and between walls
and floors;
g) no exposed water pipes crossing rooms; 4.3 Water-baths
h) filters for the air entering ventilation systems.
4.3.1 Use water-baths of the required accuracy.
It is possible to check that the measures taken are effective
simply by exposing, during an examination, open Petri dishes For precise temperature control, the water-bath shall be
with plate count agar (PCA). The number of colonies that have equipped with a circulating pump and automatic heating
developed after incubation for 3 days at 30 OC is counted and, regulation. The agitation of the water shall not cause dispersal
if this number is unacceptably high, the causes of this
of droplets.
excessive contamination shall be determined and eliminated.
There shall always be a thermometer of adequate precision, in-
dependent of the automatic control system.
4.1.5 When examinations are required to be carried out in at-
mospheres having no more than very slight contamination, the
Check the temperature at least every working day.
room shall be equipped, for example, with :
a) UV lamps, to be used outside working hours;
4.3.2 In order to avoid the development of micro-organisms in
b) special cabinets (laminar flow or completely closed). the water, clean the water-bath regularly and fill it with recently
distilled or demineralized water. Also a disinfectant may be
In such rooms, special clothing shall be worn. Check the cor-
added or the bath heated to a temperature of at least 90 OC for
rect functioning of UV lamps and cabinets at regular intervals,
a few minutes.
2
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4.3.3 In order to prevent contamination
5.1.2 Sterilization
- do not immerse tubes, bottles and flasks to too great a
Sterilize the apparatus according to one of the following
depth ; methods :
- when cotton wool plugs are used, ensure that they do
a) sterilization by dry heat : heat in a hot air sterilizer for at
not become moist (use non-absorbent cotton wool).
least 1 h at 170 to 175 OC;
4.3.4 In order to attain the correct temperature of incubation,
b) sterilization in moist heat : heat in a special autoclave,
ensure that the liquid level in tubes, bottles or flasks is below provided with a device for drying under vacuum, for at least
that of the water-bath.
20 min at 121 f 1 OC.
Place the apparatus to be sterilized in the autoclave in such a
4.3.5 Regularly count the number of micro-organisms in the
way as to allow free circulation of the steam. Before starting
water.
sterilization, evacuate the autoclave in order to reduce the
pressure to at least 13,7 kPa2). Sterilize as indicated in the first
4.4 Autoclave for sterilizing apparatus and
paragraph. After sterilization and evacuation of the steam,
culture media create a vacuum three times in succession, each time for a
period of 3 min, so as to obtain complete drying of the
The autoclave shall have a thermometer and a manometer, and
equipment.
shall be capable of attaining a temperature of at least
121 f 1 OC. In order to be certain that the apparatus has been properly
sterilized, sterilization indicators (for example special papers)
If the autoclave is used for the sterilization of apparatus, it shall can be used.
be provided with a device for the evacuation of air, in order to
reach a pressure of 13,7 kPa; for the sterilization of culture
5.1.3 Treatment of used apparatus
media, it is necessary to remove the air until a jet of steam is
emitted.
5.1.3.1 Sterilization/decontamination
The air inlet shall be provided with a filter to prevent contamina-
tion from the air during drying. All used apparatus and incubated culture media shall be steril-
ized or decontaminated, even if they have not been used for the
determination of pathogenic micro-organisms.
4.5 Sterilizing oven
Sterilize Petri dishes and tubes, bottles or flasks containing the
The oven shall enable apparatus to be sterilized at a tempera-
agars or the broths used, as well as apparatus that has come
ture of 170 to 175 OC.
into contact with the cultures of micro-organisms during the
manipulations, for 20 min at 121 OC.
Wash pipettes after removing them from the disinfectant
5 Preparation of apparatus and media
solution [see clause 7 g)] and after removing the cotton wool
plugs.
5.1 Sterilization and preparation of apparatus
Pasteur pipettes shall be used once only.
5.1.1 Preparation
5.1.3.2 Washing
All apparatus to be used shall be clean.')
Wash apparatus only after it has been sterilized or decon-
Apparatus made of plastics material and supplied sterile does
taminated.
not need to be sterilized.
Empty containers of their contents. Wash plugs carefully with
Before sterilization, stopper test tubes, bottles and flasks with
hot water, and glassware with a detergent solution or suc-
cotton wool or by means of an appropriate closure. Stopper
cessively with a solution of an alkaline detergent [for example
pipettes with cotton wool if there is a risk of contamination of
0,125 % (m/m) sodium carbonate solution1 and with a dilute
the sample (mixing by repeated aspirations) or a risk of infec-
acid [for example hydrochloric acid, c(HCI) = 0,l mol/ll.
tion to the analyst.
Wash metal capsules in hot water only.
If necessary, place the apparatus to be sterilized in special con-
tainers or wrap it in special paper or aluminium foil.
Rinse all apparatus with distilled or demineralized water.
New apparatus delivered non-sterile should be washed - see 5.1.3.2.
1)
It should be noted that the sterilization pressure is here expressed in absolute units and in kilopascals.
2)
3
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in appropriate bottles or flasks, but not exceeding 100 ml per
5.2 General techniques for the preparation and
bottle or flask.
sterilization of culture media
NOTE - Devices for the preparation and distribution of media exist, in
5.2.1 Basic components
this case refer to the specifications for use of the apparatus.
In order to improve the reproducibility of the results, it is
5.2.4 Sterilization of media
recommended that, for the preparation of culture media,
dehydrated basic components or complete dehydrated medium
Follow the instructions given in the International Standard con-
be used. The manufacturer's instructions shall be rigorously
cerned (or the manufacturer's instructions) ; generally, steriliz-
followed.
ation of culture media requires 15 min at 121 OC (245 kPa).
Basic components shall be kept in a cool dry place and
Make certain that, when culture media are sterilized, the time
sheltered from light.
required to reach the sterilization temperature and the time
necessary for cooling are not too long, in order to avoid
The chemical products used for the preparation of the culture
degradation of certain components of the medium. Do not
media shall be of recognized analytical quality.
overload the autoclave.
5.2.2 Distilled water
Degradation is more marked when a large volume of culture
media is sterilized, because the period of heating has to be
The water used shall be distilled water, free from substances
longer than for a small volume. Unless otherwise indicated, do
that could inhibit the growth of micro-organisms under the test
not sterilize volumes of more than 500 ml in the case of liquids
conditions. If distilled water is prepared from chlorinated water,
or more than 100 ml in the case of agar media. After steriliz-
neutralize the chlorine before distillation.
ation, do not reduce the pressure too rapidly, to prevent boiling
of the media.
If possible, use glass-distilled water.
As in the case of sterilization of apparatus, sterilization in-
NOTE - Water demineralized by passing throiigh an ion-exchange
dicators may be used.
column often contains large numbers of micro-organisms, thus this
procedure is not suitable for preparing water to be used directly.
Check media regularly after sterilization, notably pH, sterility
and efficiency.
5.2.3 Preparation of media
5.2.5 Storage of prepared culture media
After use, close bottles containing dehydrated culture media as
quickly as possible in order to prevent the absorption of
If the prepared culture media are not used immediately, they
moisture by the powder. Do not use such culture media when
shall, unless otherwise specified in the relevant International
they have become a compact mass.
Standard, be stored in the dark at O to 4 OC, for no longer than
1 month, in conditions which do not produce any modification
Prepare culture media in accordance with the relevant Inter-
in their composition.
national Standard or with the manufacturer's instructions.
Never use media that have become dehydrated.
Measure the pH of the medium so that after sterilization it is at
the pH required. This measurement should be made with a pH
5.2.6 Liquefaction of agar culture media and preparation
meter. Adjust the pH, if necessary,') with 40 g/l sodium
of agar plates
hydroxide solution, or 36,5 g/l hydrochloric acid.
Melt the culture medium by placing it in a boiling water-bath or
Distribute liquid culture media in the quantities as needed, so
by any other means giving similar results (for example a steam
that no transfer after sterilization is necessary.
flow-through autoclave, or a microwave oven). Avoid heating it
for too long by removing it from the water-bath as soon as it
For liquid media, use in general 10 ml in tubes of dimensions
has melted.
16 mm x 160mm or 20 ml in tubes of dimensions
20 mm x 180 mm or larger quantities in appropriate bottles or
Keep the culture medium in the molten state by leaving it in a
flasks but not exceeding 500 ml per bottle or flask. When it is
thermostatically controlled water-bath at 45 to 50 OC until it is
desired to observe the possible production of gas, tubes con-
used.
a Durham tube.
taining liquid medium can be fitted with
Never use a culture medium at a temperature higher than
The distribution of culture media can be carried out manually or 50 OC. Do not keep a medium in the molten state for longer
by using an automatic syringe.
than 4 h and never melt a medium more than once.
Distribute agar media intended for the preparation of Petri Pour agar into the dishes in such a way that a layer at least
dishes in quantities of 15 ml in test-tubes of dimensions 2 mm thick is obtained (for example, for dishes of diameter
16 mm x 160 mm, or 18 mm x 180 mm, or larger quantities 90 mm, 10 ml of agar are required).
Normally, culture media prepared from dehydrated preparations will have the desired pH and will not require adjustment.
II
4
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IS0 7218-1985 (E)
f) Sterilize inert metal loops and wires, etc. in a flame,
Unless otherwise indicated, before inoculating the surface of
media, dry them preferably with the cover removed (see before and after use. Carefully dry wet loops over the flame
before they are sterilized to avoid the projection of material.
figure 1) and the agar surface downwards, in an incubator,
When working with pathogenic micro-organisms, use a pro-
maintained at 50 OC for 30 min, until all droplets of water have
disappeared from the surface of the medium. tective bell jar (see figure 2) or another form of protection
[see, for example, Barlow (1972) Soc. Appl. Bacferiol.
Tech. Serv. No. 11;
Do not dry any further.
g) Place used pipettes, spatulas, etc., in special containers
with a disinfectant (for example sodium hypochlorite sol-
ution) before cleaning and/or sterilization.
h) Place used Petri dishes, culture media, and all other
material that may contain micro-organisms, in special
containers.
Figure 1
j) Place plastics material that is not to be reused in plastic
bags for burning or sterilization.
5.2.7 Loading of incubators
k) Take out books, journals, laboratory administration
documents, media, reagents, etc., only for as long as is
Do not overload incubators. Leave at least 25 mm between
necessary.
stacks, and between stacks and the walls and shelves. Each
@
stack shall be composed of not more than six dishes. m) Immediately remove any spilt contaminated media or
products with cotton swabs impregnated with 70 % (V/ V)
ethanol or another disinfectant and then clean and disinfect
the work surface before continuing work.
6 Sampling
Handling pathogenic or toxic material may require special pre-
Carry out sampling in accordance with the specific Inter-
cautions described in specialized literature. Some examples are
national Standard appropriate to the product concerned. If
there is no specific International Standard, it is recommended
-
working in closed areas or under laminar flow hoods,
that the parties concerned come to an agreement on this
especially when opening Petri dishes;
subject.
- using safety pipettes, etc.
Keep the product to be sampled and the samples to be exam-
ined under conditions which avoid any change in the number of The risk of infection or contamination depends on the type of
micro-organisms present. mic
...
Norme internationale @ 7218
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATIONOME~YHAPO~HAfl OPrAHMSAUMfl no CTAHAAPTM3AUMM*ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
0 Microbiologie - Directives générales pour les examens
m i c ro bi o I og i q u es
Microbiology - General guidance for microbiological examinations
Première édition - 1985-09-01
O
- CDU 579.678 Réf. na : IS0 7218-1985 (FI
k
Ln
Descripteurs : analyse microbiologique, micro-organisme, échantillonnage, produit alimentaire.
E
b!
2
i2
Prix basé sur 14 pages
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de I'ISO). L'élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I'ISO. Chaque
a le droit de faire partie du comité technique
comité membre intéressé par une étude
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I'ISO, participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I'ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I'ISO qui requièrent l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale IS0 7218 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
O Organisation internationale de normalisation, 1985 0
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NORME INTERNATIONALE IS0 7218-1985 (F)
Microbiologie - Directives générales pour les examens
m icro biolog i q ues
O Introduction 1 Objet et domaine d‘application
La présente Norme internationale donne des directives géné-
Lorsqu’on effectue des examens microbiologiques, il est spé-
rales pour la réalisation d’examens microbiologiques effectués
cialement important
selon des normes spécifiques.
a) d‘isoler ou de dénombrer seulement les micro-
Le but de la présente Norme internationale est d’aider à assurer
organismes présents dans les échantillons ;
la validité des examens, de s’assurer que les techniques géne-
b) que les micro-organismes ne contaminent pas I’envi-
rales utilisées pour effectuer ces examens sont les mêmes dans
ronnement.
tous les laboratoires et de contribuer à la protection de la santé
du personnel de laboratoire, en évitant les risques d’infection.
Pour cela il faut veiller à l’hygiène personnelle et utiliser des
techniques de travail qui assurent autant que possible des con-
ditions aseptiques.
2 Référence
Puisqu’il n‘est possible de donner dans la présente Norme inter-
IS0 6887, Microbiologie - Directives générales pour la prépa-
nationale que quelques exemples des précautions à prendre
ration des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
pendant les examens microbiologiques, la connaissance appro-
fondie des examens microbiologiques et des micro-organismes
en question est essentielle.
3 Hygiène personnelle
C‘est finalement à l’analyste de juger si les manipulations sont
Dans le domaine de l’hygiène personnelle, il faut prendre les
sûres et peuvent être considérées comme étant de bonnes pra-
précautions suivantes pour éviter la contamination des échan-
I) tiques de laboratoire.
tillons et des milieux de culture en particulier, mais également
pour éviter des risques d’infection du personnel de laboratoire :
De nombreuses manipulations peuvent par exemple entraîner
involontairement des contaminations croisées et l’analyste
- Observer scrupuleusement les précautions usuelles
devrait toujours vérifier la précision des résultats donnés par sa
d’hygiène. Couper court les ongles. Porter des protections
technique.
pour les cheveux et la barbe si nécessaire.
Afin d’exécuter les examens de facon correcte, il est évidem- - Se laver les mains à fond à l‘eau chaude et au savon
la
ment nécessaire de prendre certaines précautions lors de et après les examens micro-
liquide ou en poudre avant
construction et de l‘installation du laboratoire. Quelques-unes
biologiques, et immédiatement après chaque passage aux
de ces précautions sont mentionnées au chapitre 4.
toilettes. Utiliser des serviettes en papier ou en tissu à usage
unique.
Certaines précautions sont à prendre, non seulement pour des
-
Porter des vêtements de laboratoire propres, sans trous
raisons hygiéniques, mais également pour assurer une bonne
ni déchirures. Ils ne seront pas portés ailleurs.
reproductibilité des résultats. II n’est pas possible de spécifier
toutes les précautions à prendre selon les circonstances, mais
- Ne pas manger, boire ou fumer dans les laboratoires de
les dispositions principales lors de la préparation, la stérilisation
microbiologie.
et la conservation des milieux et du matériel, sont décrites au
chapitre 5. - Ne pas parler, tousser, etc. pendant l‘ensemencement
des boîtes et des tubes.
Si l’on suit les indications contenues dans la présente Norme
- Interdire au personnel présentant des infections sérieu-
internationale, on contribuera également à la protection de la
ses aux mains et au visage de réaliser des examens micro-
santé du personnel. On trouvera de plus amples informations à
à une
biologiques, dans le cas où ceci pourrait conduire
ce sujet dans la littérature mentionnée en bibliographie, et
contamination.
notamment dans [ll, i21 et [31.
1
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4 installations et matériel On peut vérifier l’efficacité des mesures prises, simplement en
exposant, pendant l’examen, des boîtes de Petri ouvertes con-
tenant un milieu gélosé (PCA). On détermine ensuite le nombre
4.1 Zones de travail
de colonies se développant après une incubation de 3 jours $I
30 OC. Dans le cas où ce nombre est anormalement élevé, il
4.1.1 La place doit être suffisante, afin de maintenir les zones
faut déterminer et éliminer les causes de cette contamination
de travail propres et en ordre.
excessive.
On devrait compter environ 20 m2 par analyste, y compris les
4.1.5 Lorsque l’on doit exécuter les examens en atmosphère
locaux auxiliaires (pour des travaux spéciaux, par exemple
très peu contaminée, le local doit être spécialement équipé, par
pesées, centrifugation, incubation et réfrigération).
exemple :
4.1.2 Des locaux spéciaux sont à prévoir pour
a) de lampes UV, à utiliser en dehors des heures de travail ;
a) le nettoyage de la verrerie et des autres ustensiles, et si
b) de hottes spéciales (à flux d‘air laminaire ou complète-
possible la stérilisation de la verrerie utilisée et des milieux de
ment fermées).
cultures incubés;
Dans de tels locaux, on portera des vêtements spéciaux. Véri-
b) la préparation et la stérilisation des milieux;
fier régulièrement, par exemple une fois par mois, le fonc-
c) le contrôle de la stérilité de produits alimentaires, dans
tionnement correct des lampes UV et des hottes. Contrôler
le cas où une hotte à flux laminaire n’est pas utilisée.
fréquemment le nombre de germes dans l’air en utilisant un
appareil spécial.
4.1.3 Une salle indépendante est à prévoir pour la préparation
des échantillons, dans le cas où il y a risque de contamination
4.1.6 Les places de travail doivent être protégées contre
croisée, par exemple pour les produits en poudre contenant un
l’exposition directe du soleil.
nombre élevé de micro-organismes (surtout dans le cas de
matières premières).
4.1.7 Veiller à ce que les tables de travail et l’appareillage
restent en bon état (en effet, des fêlures dans les tables de
Pour la détermination des micro-organismes pathogènes, par
travail peuvent accumuler des saletés qui sont une source de
exemple Salmonella, il est vivement conseillé de prévoir une
contamination).
salle spéciale ou tout au moins une enceinte à cet effet, non
seulement pour éviter les contaminations croisées, mais encore
pour empêcher les risques d‘infection du personnel.
4.1.8 Les locaux doivent être bien éclairés : au moins 500 Ix à
1 m du sol et au moins 1 200 Ix (lumière artificielle ((lumière du
jour))) sur les tables de travail.
4.1.4 Lors de l’installation d‘un laboratoire, il faudrait apporter
des aménagements réduisant les risques de contamination par
la poussière et donc par les micro-organismes, par exemple :
4.2 Étuves et chambres-étuves
a) placards jusqu’au plafond;
Utiliser des étuves ou des bains d’eau spéciaux lorsque la tem-
pérature doit être constante et précise à quelques dixièmes de
b) tables, rebords de fenêtre, réfrigérateurs, étuves,
enceintes d‘ensemencement installées de façon à Bviter les degré près.
nids à poussière et à faciliter le nettoyage; à cet effet, on
peut utiliser du matériel amovible;
4.2.1 Les étuves doivent être bien isolées et équipées de
cl fenêtres et portes fermant hermétiquement (pour éviter façon adéquate avec des unités de chauffage et les étuves de
des courants d’air) ; grandes dimensions doivent avoir une circulation d’air forcée,
afin d’être sûr que la température est partout correcte à 1 OC
d) vénitiennes, etc., installées à l‘extérieur des fenêtres;
près.
el armoires fermées pour le rangement des documents uti-
lisés lors des manipulations, des échantillons, milieux, réac-
4.2.2 La température ambiante doit toujours être plus basse
tifs, etc.;
que celle de l’étuve ou bien cette dernière doit être munie d‘un
système de refroidissement.
NOTE - Il convient que les périodiques, les livres qui ne sont pas
fréquemment utilisés soient placés dans une pièce spéciale
(bureau, par exemple) située à l’extérieur de la salle d‘analyse.
4.2.3 La température doit être vérifiée au moins tous les jours
f) murs, plafonds, sols et meubles à surfaces lisses, faciles d’utilisation.
à nettoyer et, si nécessaire, à désinfecter, et avec joints
incurvés entre les murs et les plafonds, et entre les murs et
Dans ce but, chaque étuve doit contenir au moins un thermo-
les sols;
mètre dont le réservoir est immergé dans de la glycérine se trou-
vant dans un flacon fermé et un thermomètre à maxima et
g) pas de conduites d‘eau traversant les locaux, à moins
minima. Les grandes étuves et les chambres-étuves doivent
qu’elles ne soient enfermées hermétiquement ;
être équipées de plusieurs thermomètres et thermomètres à
maxima et minima répartis de façon convenable.
h) systèmes de ventilation à filtres pour l’air aspiré.
2
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4.3 Bains d’eau
5 Préparation du matériel et des milieux
4.3.1 On doit utiliser des bains d’eau à la précision demandée.
5.1 Stérilisation et préparation du matériel
Pour un réglage précis de la température, le bain d‘eau doit être
5.1.1 Préparation
équipé d’une pompe à circulation et d’un système de réglage
automatique de chauffage. L‘agitation de l‘eau ne doit pas pro-
Tout le matériel à utiliser doit être propre’)
voquer la projection de gouttes.
II n‘est pas nécessaire de stériliser le matériel en matière plasti-
II doit toujours y avoir un thermomètre de précision convena-
que déjà stérile.
ble, indépendant du système de réglage automatique.
Avant stérilisation, boucher les tubes à essai et les flacons avec
Vérifier la température au moins chaque jour d’utilisation.
du coton ou avec une fermeture appropriée. Boucher les pipet-
tes avec du coton s‘il existe un risque de contamination de
l‘échantillon (mixage par aspirations répétées) ou bien un risque
4.3.2 Afin d’éviter le développement de micro-organismes
d’infection de l’analyste.
dans l’eau, nettoyer le bain d‘eau régulièrement et le remplir
d‘eau récemment distillée ou déminéralisée. On peut également
à stériliser dans des récipients
Si nécessaire, placer le matériel
ajouter un désinfectant ou chauffer l‘eau au bain d’eau,, pen-
rl)
spéciaux ou l’envelopper dans du papier spécial ou une feuille
dant quelques instants, à une température d’au moins 90 OC.
d’aluminium.
4.3.3 Afin d’éviter les contaminations,
5.1.2 Stérilisation
-
ne pas immerger les tubes et les flacons trop profon-
Stériliser le matériel selon l’une des méthodes suivantes
dément;
a) stérilisation par chaleur sèche: chauffer dans un stérili-
-
lorsque des bouchons en coton sont utilisés, prendre
sateur à air chaud pendant au moins 1 h à 170 - 175 OC.
soin qu’ils ne se mouillent pas (utiliser du coton cardé).
b) stérilisation par chaleur humide: chauffer pendant au
moins 20 min à 121 f 1 OC dans un autoclave spécial muni
4.3.4 Afin d‘obtenir une température correcte d’incubation,
d‘un dispositif de séchage sous vide.
veiller à ce que le niveau de liquide dans les tubes ou flacons
soit en dessous du niveau du bain d‘eau.
Disposer dans l’autoclave le matériel à stériliser, de façon à per-
mettre la libre circulation de la vapeur. Avant le début de la
stérilisation, faire le vide dans l’autoclave pour réduire la pres-
4.3.5 Procéder régulièrement à des dénombrements de micro-
sion à au moins 13,7 kPa.*) Stériliser comme indiqué ci-dessus.
organismes dans l’eau.
Après la stérilisation et après élimination de la vapeur, on peut
par exemple, afin d’avoir un séchage parfait du matériel, faire
4.4 Autoclave pour la stérilisation du matériel et successivement trois fois le vide pendant une durée de trois fois
1)
3 min.
des milieux de culture
On peut utiliser des indicateurs de stérilisation dans le but de
L‘autoclave doit avoir un thermomètre et un manomètre et doit
s’assurer que celle-ci a bien eu lieu (par exemple, papiers
permettre d’atteindre une température d’au moins 121 f 1 OC.
spéciaux).
Si l’autoclave est utilisé pour la stérilisation du matériel, il doit
être muni d’un dispositif pour l’évacuation de l’air, afin d’attein-
5.1.3 Traitement du matériel utilisé
dre une pression de 13,7 kPa, et dans le cas contraire, il est
nécessaire de le purger de son air jusqu‘à émission d’un jet
Stérilisation/décontamination
5.1.3.1
continu de vapeur.
II faut toujours stériliser ou décontaminer tout le matériel utilisé
Le dispositif d’entrée de l’air doit être muni d’un filtre pour évi-
et les milieux incubés, même s’ils n‘ont pas été employés pour
ter la contamination par l’air lors du séchage.
la recherche de micro-organismes pathogènes.
4.5 Four à stériliser Stériliser pendant 20 min à 121 f 1 OC les boîtes de Petri et les
tubes ou flacons contenant les géloses ou les bouillons utilisés
Le four doit permettre de stériliser le matériel à une température
ainsi que le matériel entré en contact avec des cultures de
de 170 à 175 OC. micro-organismes pendant les manipulations.
11 Le matériel neuf livré non stérile doit être lavé (voir lavage préconisé en 5.1.3.2).
II est important de noter que la pression de stérilisation est donnée ici en valeur absolue et en kilopascals.
2)
3
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Préparer les milieux de culture en suivant les indications de la
Laver les pipettes après les avoir retirées de la solution désinfec-
tante [voir 7 g)] et enlever les bouchons en coton. Norme internationale concernée ou les indications du fabricant.
Mesurer le pH du milieu, de sorte qu'après stérilisation il soit au
Les pipettes Pasteur ne doivent être utilisées qu'une seule fois.
pH demandé. Cette mesure devrait être effectuée avec un
pH-mètre. Ajuster le pH, si nécessaire1), avec une solution
5.1.3.2 Lavage
d'hydroxyde de sodium à 40 g/l ou une solution d'acide
chlorhydrique à 36,5 g/l.
Ne laver le matériel qu'après sa stérilisation ou décontami-
nation.
Pour les milieux liquides, répartir la quantité demandée de
façon à ne rien avoir à transférer après stérilisation.
Vider les récipients de leur contenu.
Utiliser en général 10 ml dans des tubes de dimensions
Laver soigneusement les bouchons à l'eau chaude et la verrerie
16 mm x 160 mm, ou 20 ml dans des tubes de dimensions
avec une solution détergente ou par passage dans une solution 20 mm x 200 mm, ou des quantités plus grandes dans des
détergente alcaline [par exemple une solution de carbonate de
tubes ou flacons appropriés, mais au maximum 500 ml par
sodium à 0,125 (rnlrnll suivi d'un passage dans de l'acide dilué flacon. Lorsque l'on désire observer une éventuelle production
[par exemple, acide chlorhydrique, c(HCI) = 0,l mol/ll.
de gaz, les tubes peuvent être munis d'une cloche de Durham.
La répartition des milieux de culture peut être effectuée
Les capsules en métal seront lavées uniquement à l'eau
manuellement ou à l'aide d'une seringue automatique.
chaude.
Pour les géloses destinées à être coulées dans les boîtes de
Rincer tout le matériel à l'eau distillée ou déminéralisée.
Petri, répartir à raison de 15 ml par tube dans des tubes à essai
16 mm x 160 mm ou 18 mm x 180 mm ou de
de dimensions
quantités plus grandes dans des tubes ou flacons appropriés,
5.2 Techniques générales pour la préparation et
mais au maximum 100 ml par flacon.
la stérilisation des milieux de culture
NOTE - II existe des appareillages pour préparer et répartir les milieux,
dans ce cas se référer aux spécifications pour l'utilisation de l'appareil.
5.2.1 Composants de base
5.2.4 Stérilisation des milieux
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
mandé d'utiliser, pour la préparation des milieux de culture, des
Suivre les indications données dans la
Norme internationale
composants de base déshydratés ou un milieu complet déshy-
concernée (sinon suivre les instructions du fabricant) ; généra-
draté. Les instructions du fabricant doivent être suivies scrupu-
lement la stérilisation des milieux de culture est de 15 min à
leusement.
121 OC (245 kPa).
Les composants de base doivent être conserv6s dans un
Veiller à ce que, lors de la stérilisation des milieux de culture, le
endroit frais, sec et à l'abri de la lumière.
temps pour atteindre la température de stérilisation et le temps
nécessaire au refroidissement ne soient pas trop longs, afin
Les produits chimiques utilisés pour la préparation des milieux
d'éviter la dégradation de certains composants du milieu. Ne
de culture doivent être de qualité analytique reconnue.
pas surcharge l'autoclave.
5.2.2 Eau distillée
La dégradation est plus forte lors de la stérilisation d'un grand
volume, pour lequel la durée de chauffage est plus longue que
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée, exempte de substances
dans le cas d'un petit volume. Sauf indications contraires, ne
susceptibles d'inhiber la croissance des micro-organismes dans
pas stériliser des volumes de plus de 500 ml dans le cas des
les conditions d'essai. Si l'eau distillée est préparée à partir
liquides ou de plus de 100 ml pour les géloses. Après la stérilisa-
d'eau chlorée, neutraliser le chlore avant la distillation.
tion, ne pas réduire la pression trop rapidement pour éviter que
les fermetures des récipients ne soient soulevées par l'ébullition
Utiliser si possible de l'eau distillée sur verre.
des milieux.
NOTE - L'eau déminéralisée par brassage sur résine échangeuse
Comme dans le cas de la stérilisation du matériel, on peut utili-
d'ions est souvent très chargée en micro-organismes, ainsi convient-il
ser des indicateurs de stérilisation.
de ne pas utiliser ce procédé pour obtenir l'eau prête à l'emploi.
Contrôler régulièrement les milieux après stérilisation, notam-
ment leurs pH, stérilité et efficacité.
5.2.3 Préparation des milieux
Après chaque ouverture, refermer le plus rapidement possible
5.2.5 Conservation des milieux de culture préparés
les flacons contenant les composants de base ou les milieux de
culture déshydratés, afin d'éviter toute humidification de la Si les milieux de culture préparés ne sont pas utilisés extempo-
poudre. Ne pas les employer quand ils sont pris en masse. ranément, ils doivent, sauf spécification indiquée dans la
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Norme internationale concernée, être conservés à l'obscurité à préparer une solution ou suspension (suspension-mère) ; on
examine ensuite celle-ci et/ou les dilutions de celle-ci. Dans un
environ 4 OC pendant 1 mois au maximum, dans des conditions
évitant toute modification de leur composition. but de simplification, on parlera toujours d'inoculum.
Ne jamais utiliser des milieux qui se sont desséchés. Pour la préparation des dilutions, voir IS0 6887
5.2.6 Fusion des milieux de culture gélosés et
7 Précautions hygiéniques pendant l'examen
préparation des boîtes de gélose
Des précautions doivent être prises pour travailler le plus possi-
Faire fondre le milieu de culture en le placant dans un bain
ble dans des conditions aseptiques, par exemple
d'eau bouillante ou selon tout autre procédé donnant des résul-
tats identiques (par exemple, autoclave en vapeur fluante ou
a) S'assurer que la zone de travail est propre et qu'il n'y a
four à micro-ondes). Éviter de le chauffer trop longtemps en le
pas de courant d'air.
retirant du bain d'eau dès qu'il est fondu.
Nettoyer la surface de travail avec un désinfectant
b)
Maintenir le milieu de culture en fusion jusqu'au moment de
approprié à la fois avant et après le travail.
45 à 50 OC.
son emploi dans un bain d'eau thermostaté de
c) Ouvrir les tubes à essais et les flacons à proximité d'une
Ne jamais utiliser un milieu de culture à une température supé-
flamme en les tenant le plus inclinés possible.
0
rieure à 50 OC. Ne pas maintenir un milieu en surfusion plus de
4 h et ne jamais le faire refondre.
Effectuer le travail le plus rapidement possible sans faire
d)
de mouvements inutiles.
Couler la gélose dans les boîtes de facon à obtenir une épais-
e) Si la totalité d'un sachet de pipettes jetables, boîtes de
seur d'au moins 2 mm (par exemple pour des boîtes de 90 mm
Petri, etc. n'est pas utilisée au cours d'une opération,
de diamètre, il faut normalement au minimum 10 ml de gélose).
s'assurer que le récipient est bien fermé après avoir prélevé
En général, pour l'ensemencement du milieu gélosé en surface, le nombre d'unités appropriées.
sécher les boîtes, de préférence avec le couvercle enlevé (voir
f) Stériliser les anses et les fils à ensemencer, etc., avant et
figure 1) et avec la surface de la gélose tournée vers le bas,
après usage à la flamme. Pour éviter des projections de
dans une étuve réglée pendant environ 30 min à 50 OC, jusqu'à
matière, sécher soigneusement, au-dessus de la flamme, les
disparition des gouttelettes d'eau à la surface du milieu.
anses humides avant de les stériliser. Lors de la manipula-
tion de micro-organismes pathogènes, utiliser une cloche de
Ne pas sécher davantage.
protection en verre (voir figure 2) ou une autre protection
[voir par exemple Barlow 11972) Soc. Appl. Bacterio/. Tech.
Sew. No. 11.
g) Placer les pipettes, spatules, etc., utilisées dans des
récipients spécifiques contenant un désinfectant (par exem-
ple, solution d'hypochlorite de sodium) avant de les stérili-
ser ou de les nettoyer.
Figure 1
h) Placer les boîtes de Petri, milieux de culture et tout
autre matériel pouvant contenir des micro-organismes, dans
des récipients spécifiques.
5.2.7 Chargement des étuves
j) Placer le matériel en matière plastique à jeter dans des
sacs en plastique, pour les brûler ou les stériliser.
Ne pas surcharger les étuves. Laisser au moins 25 mm entre
deux piles et entre les piles et les parois ou les rayons. Chaque
k) Sortir les livres, journaux, documents administratifs du
pile contiendra au maximum six boîtes.
laboratoire, milieux, réactifs, etc., juste le temps nécessaire.
m) Enlever immédiatement tous milieux ou produits con-
6 Échantillonnage
taminés, qui auraient pu se répandre, au moyen de tampons
de coton imprégnés d'éthanol à 70 % (V/ V) ou d'un autre
Effectuer l'échantillonnage conformément à la norme spéci-
désinfectant, puis nettoyer et désinfecter la surface de tra-
fique du produit concerné. S'il n'y a pas de norme spécifique
vail avant de continuer.
disponible, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d'accord à ce sujet.
La manipulation de produits pathogènes ou toxiques peut
demander des précautions particulières décrites dans des
à échantillonner et les échantillons à exa-
Conserver le produit
ouvrages spécialisés. Quelques exemples sont les suivants :
miner dans des conditions qui évitent une modification du nom-
bre de micro-organismes présents.
- travail dans des enceintes fermées ou sous hotte à flux
laminaire, notamment lors de l'ouverture des boîtes de
Pour dénombrer des micro-organismes dans un produit liquide,
Petri;
on peut l'examiner tel quel ou bien examiner les dilutions de
-
celui-ci. Pour les produits solides, il est toujours nécessaire de utilisation de pipettes de sécurité, etc.
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Dimensions en millimètres
O
=I
0, @ et @ en laiton nickelé
Ballon rond de 1 O00 ml transformé
@
Figure 2 - Brûleur à gaz avec cloche de protection en verre
6
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Le risque d‘infection ou de contamination dépend du type des correspondants au plan d’ensemencement spécifié dans la
micro-organismes et des manipulations nécessaires pendant
Norme internationale concernée.
l’examen.
Répartir dans les boîtes marquées, selon 8, les volumes déter-
Les aérosols contaminés sont une cause importante de conta-
minés des dilutions à examiner.
mination de l’environnement et d’infection. II faut donc éviter
autant que possible la formation d‘aérosols. Ils peuvent se for-
Verser dans chaque boîte le volume de milieu prescrit en 5.2.6.
mer pendant l‘ouverture des boîtes, tubes et flacons, lors de
Le temps qui s‘écoule entre le moment où l‘on a distribué I’ino-
l’utilisation d’agitateurs, seringues, centrifugeuses, etc., ainsi
culum dans une boîte et celui où le milieu est coulé ne doit pas
que lorsque l‘on vide des pipettes en soufflant, lors de la stérili-
excéder 15 min. Mélanger soigneusement et immédiatement le
sation d’anses ou fils à ensemencer humides. Lors de I’ouver-
et I’inoculum, de facon à obtenir une répartition
milieu fondu
ture d‘ampoules contenant des cultures lyophilisées, on peut
homogène des micro-organismes dans la masse du milieu. Lais-
également répandre des micro-organismes dans l‘air.
ser refroidir et solidifier en posant les boîtes de Petri sur une
surface fraîche et horizontale.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Prévoir une deuxième couche de gélose non nutritive ou identi-
que à celle du milieu de culture utilisé dans l’analyse en vue
Marquer les échantillons, les récipients, les sachets en matière
d‘éviter la croissance des colonies envahissantes.
plastique, les flacons, les tubes à essais, les boîtes de Petri, etc.
de façon qu’ils puissent être facilement identifiés pendant
0
Placer, après solidification complète du milieu, les boîtes à
toutes les étapes de l‘examen pour éviter toute possibilité de
incuber selon les indications données en 9.2.1.3.
confusion.
Manipuler les échantillons de facon à éviter tout risque de con-
9.2.1.2 Technique par étalement
tamination. Pour cela, prendre les précautions suivantes :
Étaler de facon uniforme et le plus rapidement possible I’inocu-
a) Lorsqu‘il s‘agit d‘un produit dans un emballage, net-
lum à la surface du milieu contenu dans les boîtes de Petri pré-
à
toyer la partie extérieure qui sera ouverte avec de l‘éthanol
parées selon 5.2.6. L‘étalement peut être réalisé à l‘aide d’un
70 % (V/V). Flamber si possible.
étaleur stérile en verre ou en matière plastique stérile.
b) Tout instrument servant à ouvrir un emballage (ouvre-
boîte, ciseaux, etc.) doit être stérile (ces instruments doi- Lorsque I’inoculum étalé a été totalement absorbé par le milieu,
procéder à l’incubation comme décrit en 9.2.1.3.
vent être stérilisés après avoir été emballés séparément dans
une matière adéquate).
9.2.1.3 Incubation
9 Mode opératoire
à la température
Incuber les boîtes ensemencées retournées
appropriée. En principe, une étuve à air est suffisante. Si une
9.1 Prise d’essai, suspension-mère et dilution
déshydratation excessive se produit (par exemple à 55 OC ou
dans le cas d‘une forte circulation d’air), envelopper les boîtes
Pour éviter la contamination de l’environnement et de la prise
sans serrer dans des sacs en matière plastique avant I’incu-
d’essai, il est recommandé de travailler dans des locaux particu-
0
bation.
liers ou sous des hottes. À défaut, on doit toujours examiner en
premier les produits contenant peu de micro-organismes, par
Si l‘on exige de faibles variations de température, mettre les
exemple les produits pasteurisés, les plats précuisinés, puis
boîtes dans un récipient étanche placé dans un bain d’eau
ceux qui sont plus fortement contaminés.
thermostaté.
La protection de l‘environnement contre la pollution est parti-
NOTE - II peut être utile dans certains cas de prévoir des boîtes ense-
culièrement importante pour la pesée et la prise d’essai des pro-
mencées en double, qui seront conservées à +4 OC pour les comparer
duits pulvérulents fortement contaminés.
lors du dénombrement avec les boîtes ensemencées incubées, afin de
ne pas confondre des particules du produit examiné avec des colonies.
Pour vérifier la stérilité d‘un produit, la prise d’essai doit s‘effec-
tuer dans des conditions d’environnement strictement contrô-
Après incubation, les boîtes doivent être, si possible, immédia-
à flux laminaire.
lées, par exemple sous une hotte
tement examinées. Sinon, elles peuvent être conservées, sauf
48 h à +4 OC.
spécification contraire, au maximum
Pour la pré
...
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