Food products — Determination of the total nitrogen content by combustion according to the Dumas principle and calculation of the crude protein content — Part 2: Cereals, pulses and milled cereal products

ISO 16634-2:2016 specifies a method for the determination of the total nitrogen content and the calculation of the crude protein content of cereals, pulses and milled cereal products. This method, like the Kjeldahl method (see References [1] and [6]), does not distinguish between protein nitrogen and non-protein nitrogen. For the calculation of the protein content, various conversion factors are used (see 3.2).

Produits alimentaires — Détermination de la teneur en azote total par combustion selon le principe Dumas et calcul de la teneur en protéines brutes — Partie 2: Céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture

ISO 16634-2:2016 spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en azote total et le calcul de la teneur en protéines brutes des céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture. Cette méthode, comme la méthode de Kjeldahl (voir Références [1] et [6]), ne distingue pas l'azote protéique de l'azote non protéique. Divers facteurs de conversion sont utilisés pour le calcul de la teneur en protéines (voir 3.2).

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19-May-2016
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ISO 16634-2:2016 - Food products -- Determination of the total nitrogen content by combustion according to the Dumas principle and calculation of the crude protein content
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16634-2
First edition
2016-05-15
Food products — Determination of the
total nitrogen content by combustion
according to the Dumas principle
and calculation of the crude protein
content —
Part 2:
Cereals, pulses and milled cereal
products
Produits alimentaires — Détermination de la teneur en azote total
par combustion selon le principe Dumas et calcul de la teneur en
protéines brutes —
Partie 2: Céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture
Reference number
ISO 16634-2:2016(E)
ISO 2016
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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ISO 16634-2:2016(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 3

8 Preparation of the test sample ............................................................................................................................................................... 3

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

9.2 Test portion ................................................................................................................................................................................................ 4

9.3 Control of oxygen supply ................................................................................................................................................................ 4

9.4 Calibration .................................................................................................................................................................................................. 5

9.5 Determination ......................................................................................................................................................................................... 5

9.6 Detection and data processing .................................................................................................................................................. 5

10 Calculation and expression of results ............................................................................................................................................. 6

10.1 Calculation .................................................................................................................................................................................................. 6

10.1.1 Nitrogen content .............................................................................................................................................................. 6

10.1.2 Crude protein content ................................................................................................................................................. 6

10.2 Expression of results .......................................................................................................................................................................... 6

11 Precision ....................................................................................................................................................................................................................... 6

11.1 Interlaboratory tests .......................................................................................................................................................................... 6

11.2 Repeatability ............................................................................................................................................................................................. 7

11.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................... 7

11.4 Critical difference.................................................................................................................................................................................. 7

11.4.1 Comparison of two groups of measurements in the same laboratory .............................. 7

11.4.2 Comparison of two groups of measurements in two different laboratories ................ 8

11.5 Uncertainty ................................................................................................................................................................................................. 8

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 8

Annex A (informative) Flowchart for a basic Dumas apparatus .............................................................................................. 9

Annex B (informative) Schematic diagrams of suitable types of Dumas apparatus ........................................10

Annex C (informative) Equipment calibration ........................................................................................................................................13

Annex D (informative) Results of interlaboratory tests ................................................................................................................15

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................22

© ISO 2016 – All rights reserved iii
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ISO 16634-2:2016(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 4, Cereals

and pulses.

This first edition cancels and replaces ISO/TS 16634-2:2009, which has been technically revised.

ISO 16634 consists of the following parts, under the general title, Food products — Determination of the

total nitrogen content by combustion according to the Dumas principle and calculation of the crude protein

content:
— Part 1: Oilseeds and animal feeding stuffs
— Part 2: Cereals, pulses and milled cereal products
iv © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 16634-2:2016(E)
Introduction

For a long time, the Kjeldahl method has been the most frequently used method for the determination

of the protein content of food products. In recent years, the Dumas method has gained importance

compared to the Kjeldahl method because it is faster and does not use dangerous chemicals. Although

the principles of the two methods are different, both measure the nitrogen content of the product.

Nitrogen content can be converted into protein content by using an appropriate factor. The value of this

factor varies depending on the relative amounts of different proteins and their amino-acid composition

in a given product.

Neither the Dumas nor the Kjeldahl method distinguishes between protein and non-protein nitrogen.

In most cases, results obtained by the Dumas method are slightly higher than those of the Kjeldahl

method. This is because the Dumas method measures almost all of the non-protein nitrogen, whereas

the Kjeldahl method measures only a part of it.

Taking into consideration that the protein content of a product calculated by both methods only

approximates to the true value, it is a matter of discretion which one is accepted. The best solution is

to use a second factor for the elimination of the systematic error caused by the non-protein nitrogen

content of the different products.

However, this second factor has to be determined for each product like the existing factors which

indicate the ratio of the protein content to the nitrogen content.
© ISO 2016 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16634-2:2016(E)
Food products — Determination of the total nitrogen
content by combustion according to the Dumas principle
and calculation of the crude protein content —
Part 2:
Cereals, pulses and milled cereal products
1 Scope

This part of ISO 16634 specifies a method for the determination of the total nitrogen content and the

calculation of the crude protein content of cereals, pulses and milled cereal products.

This method, like the Kjeldahl method (see References [1] and [6]), does not distinguish between protein

nitrogen and non-protein nitrogen. For the calculation of the protein content, various conversion factors

are used (see 3.2).
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 712, Cereals and cereal products — Determination of moisture content — Reference method

ISO 6540, Maize — Determination of moisture content (on milled grains and on whole grains)

ISO 24557, Pulses — Determination of moisture content — Air-oven method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
nitrogen content
mass fraction of the total nitrogen

Note 1 to entry: Determined by the procedure specified in this part of ISO 16634.

Note 2 to entry: The mass fraction is expressed as a percentage.
3.2
crude protein content
nitrogen content (3.1) multiplied by a factor

Note 1 to entry: A 5,7 factor is generally used for cereals for human food (such as wheat, rye and their milled

products) and 6,25 for malting barley and cereals for feed and other products falling within the scope of this part

of ISO 16634.

Note 2 to entry: The factors for calculation of the crude protein content from the total nitrogen content are

derived from the Kjeldahl method, which is the reference method for the determination of total nitrogen content.

© ISO 2016 – All rights reserved 1
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ISO 16634-2:2016(E)
4 Principle

Samples are converted into gases by heating in a combustion tube. Interfering components are removed

from the resulting gas mixture. The nitrogen compounds in the gas mixture, or a representative

part of them, are converted to molecular nitrogen which is quantitatively determined by a thermal-

conductivity detector. The nitrogen content is calculated by a microprocessor.
5 Reagents

Use only reagents of recognized analytical grade or reagents of equivalent purity as specified by

instrument manufacturers. Except for the reference materials (5.12), all reagents shall be free from

nitrogen.
5.1 Carrier gas(es), use either 5.1.1 or 5.1.2.

5.1.1 Carbon dioxide, as pure as possible, but with a minimum CO volume fraction of 99,99 %.

5.1.2 Helium, as pure as possible, but with a minimum He volume fraction of 99,99 %.

5.2 Oxygen, as pure as possible, but with a minimum O volume fraction of 99,99 %.

5.3 Sulfur dioxide and halogen absorbent, to eliminate any sulfur from the sample [e.g. lead

chromate (PbCrO ) or steel wool].
5.4 Copper oxide/platinum catalyst, for the post-combustion tube.

Platinum catalyst [5 % of Pt on alumina (Al O )] is blended with CuO in the ratio 1 part:7 parts or

2 3
1 part:8 parts in accordance with the manufacturer’s recommendations.

To prevent separation as a result of the different bulk densities of the two materials, it is recommended

not to prepare the mixture before filling the tube, but to pour the platinum catalyst and copper oxide

simultaneously into the post-combustion tube using a suitable funnel.
5.5 Silver or copper wool.

This shall be disaggregated before being inserted into the post-combustion or reduction tube.

5.6 Silica (quartz) or glass wool or cotton wool, as recommended by the instrument manufacturer.

5.7 Copper or tungsten (wire, cuttings, turnings or powder), for the reduction tube.

The use of copper or tungsten in one of these forms can improve the precision of analytical results for

samples with low nitrogen contents (about 1 % mass fraction).

5.8 Diphosphorus pentoxide (P O ) or granulated magnesium perchlorate [Mg(ClO ) ], or

2 5 4 2
another suitable drying agent, to fill the drying tubes.
5.9 Hollow corundum spheres or aluminium oxide pellets, for the combustion tube.
5.10 Copper oxide (CuO), as filling material for the combustion tube.
5.11 Sodium hydroxide (NaOH), on a support material.
2 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 16634-2:2016(E)

5.12 Aspartic acid (C H NO ) or ethylenediaminetetraacetic acid (C H N O ) or glutamic acid

4 7 4 10 16 2 8

(C H NO ) or hippuric acid (C H NO ) standard, or other suitable reference materials with a known,

5 9 4 9 9 3
constant, certified nitrogen content.
The minimum recovery should preferably be 99 % mass fraction.

5.13 Light petroleum, with a boiling range between 30 °C and 60 °C, or acetone or ethanol.

6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 1 g.
6.2 Grinding device, appropriate to the nature of the sample.
6.3 Sieve, of nominal opening size 800 µm or 1 mm, made of non-ferrous material.

6.4 Crucibles (e.g. made of stainless steel, quartz, ceramic material or platinum) or tin capsules

or tin foils or nitrogen-free filter paper, suitable for the Dumas apparatus used.

NOTE 1 Several instruments provided with an automatic sampler are commercially available.

NOTE 2 Some solid samples (e.g. powders) can be pressed to form pellets.

6.5 Dumas apparatus, fitted with a furnace able to maintain a given temperature greater than or

equal to 850 °C, with a thermal-conductivity detector and suitable device for signal integration.

Suitable Dumas apparatus operates according to the general flowchart given in Annex A, although

different arrangements and components may be used.

NOTE Schematic diagrams of three commercially available instruments are shown as examples in

Figures B.1 to B.3.

To avoid leaks, the sealing O-rings shall be slightly lubricated with high-vacuum grease prior to

installation.

Experience has shown that it is important to clean all pieces of silicaware and glassware carefully

and to remove fingerprints from tubes, using a suitable solvent (5.13), before inserting them into the

furnace.
7 Sampling

A representative sample should have been sent to the laboratory. This sample should not have been

damaged or changed during transport or storage.

Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 16634. Recommended sampling methods

are given in ISO 24333 for cereals and cereal products.
8 Preparation of the test sample

The test sample shall be prepared from the laboratory sample in such a way that a homogeneous test

sample is obtained.

Using a suitable grinding device (6.2), grind the laboratory sample. Generally, pass the ground material

through a sieve (6.3) of nominal opening size 800 µm for small sample sizes (under 300 mg) or a sieve of

© ISO 2016 – All rights reserved 3
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ISO 16634-2:2016(E)

nominal opening size 1 mm for larger sample sizes (300 mg or more). Mills that produce particle sizes

meeting the specifications given in Table 1 will give acceptable results.
Table 1 — Required particle size
Nominal size of sieve openings Amount passing through sieve
µm % mass fraction
710 100
500 95 to 100
200 85 or less

Grinding may result in moisture loss and, therefore, the moisture content of the ground sample should

preferably also be determined when reporting nitrogen or protein contents on a dry-matter or constant-

moisture basis. Determination of the moisture content shall be carried out in accordance with ISO 712

for cereals other than maize, ISO 6540 for maize and ISO 24557 for pulses.

The grinder efficiency can be checked by replicate preparation of ground samples of a 2 + 1 mixture of

maize and soya seeds. The expected coefficient of variation should be less than 2 % mass fraction.

9 Procedure
9.1 General

Carefully, follow the manufacturer’s instructions for instrument set-up, optimization, calibration and

operation. Switch the instrument on and allow it to stabilize as defined in local procedures.

An instrument performance test should be carried out daily, using the reference material (5.12). The

recovery of nitrogen should be >99,0 % mass fraction.
9.2 Test portion

Weigh, to the nearest 0,000 1 g, at least 0,1 g of the test sample into a crucible or tin capsule or nitrogen-

free filter paper (6.4). For samples low in protein (<1 % mass fraction), the amount of the test portion

can be increased up to 3,5 g, depending on the type of Dumas equipment being used and on the nature

of the sample.

Depending on the type of equipment used, if the sample contains over 17 % mass fraction of moisture,

drying may be necessary before analysis.

Lower test portions may be necessary for very high protein content samples or when only very small

amounts of sample are available. In the case of portions below 0,1 g, a second (validation) determination

shall be performed.
9.3 Control of oxygen supply

Control the oxygen supply, in particular the flow, in accordance with the instructions of the material

supplier.

With each series of nitrogen content determinations, conduct as many blank runs as necessary to

stabilize the equipment, using for each run an equivalent mass of sucrose in place of the test portion.

The sucrose blank provides the amount of nitrogen that is introduced in the form of atmospheric air

trapped within a powdered organic material. Use the mean value of the blank determinations as an

error correction in the calculation of the nitrogen content of each test sample.
4 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 16634-2:2016(E)
9.4 Calibration

For instrument calibration, use pure compounds with a known, constant nitrogen content, e.g. aspartic

acid (5.12), as standards. Analyse in duplicate, three pure compounds, each in three different amounts

chosen as a function of the measurement range for the actual samples.

To prepare a calibration curve, carry out at least five determinations with different amounts of the

same compound, choosing the compound and the amounts used in such a way that the curve obtained

will cover the range of nitrogen contents in the samples to be analysed.

If the test portion contains more than 200 mg of nitrogen, the calibration curve is likely to be nonlinear.

In the nonlinear section, short segments can, nevertheless, be used for calibration purposes. To ensure

the reliability of the curve in these segments, the amount of standard used shall be increased in steps

corresponding to 1 mg to 5 mg of nitrogen over the segments.
Calibration can also be performed using standard aqueous solutions.

Check the calibration at least three times at the beginning of a series of analyses and then, after every

15 to 25 samples, analysing either one of the standards (5.12) or a sample of known value. The value

obtained for the nitrogen mass fraction shall differ by less than 0,05 % from the expected value. If it

does not, repeat the calibration check after checking instrument performance.
9.5 Determination

With the instrument operating in the stable state, introduce the test portion in accordance with the

manufacturer’s instructions.

During the analysis, the following processes take place in the instrument (see Figures B.1, B.2 or B.3).

The test portion is quantitatively combusted under standard conditions at a temperature of at least

850 °C, depending on the instrument and the material being analysed.

Volatile decomposition products (mainly molecular nitrogen, nitrogen oxides, carbon dioxide and water

vapour) are transported by the carrier gas (5.1) through the instrument.

Nitrogen oxides are reduced to molecular nitrogen, and the excess oxygen is bound to the copper or

tungsten (5.7) in the reduction column.

Water is removed by drying tubes filled with magnesium perchlorate, diphosphorus pentoxide or

another drying agent (5.8). If carbon dioxide is used as the carrier gas (5.1.1), it is removed by being

passed over a suitable absorbent, e.g. sodium hydroxide (5.11), on a suitable support material.

Interfering compounds (e.g. volatile halogen and sulfur compounds) are removed by absorbents (5.3)

or chemical reagents, e.g. silver wool (5.5) or sodium hydroxide (5.11), on a suitable support material.

The remaining gas mixture, consisting of nitrogen and carrier gas, is passed through a thermal-

conductivity detector.
9.6 Detection and data processing

For quantitative nitrogen determination, the instrument uses a sensitive thermal-conductivity cell

that is optimized for the carrier gas employed and that may have automatic zero adjustment between

measurements on successive test portions. After amplification and analogue/digital conversion of the

detector signal, the data obtained are processed by peripheral microprocessor hardware.

© ISO 2016 – All rights reserved 5
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ISO 16634-2:2016(E)
10 Calculation and expression of results
10.1 Calculation
10.1.1 Nitrogen content

The results for the total nitrogen content, w , expressed as a percentage mass fraction, are usually

available in the form of instrument printouts.
10.1.2 Crude protein content
The correction factor, F , is obtained from Formula (1):
100−w
HO,1
F = (1)
100−w
HO,2
where
is the moisture mass fraction, expressed as a percentage, before grinding;
HO,1
is the moisture mass fraction, expressed as a percentage, after grinding.
HO,2

The crude protein content, w , expressed as a percentage mass fraction, is obtained from Formula (2):

w = w F F (2)
p N c
where

w is the nitrogen content, expressed as a percentage mass fraction, of the sample at its natural

moisture content;

F is the generally agreed conversion factor for the product analysed, equal to 5,7 for cereals for

human food (such as wheat, rye and their milled products) and 6,25 for malting barley and

cereals for feed and other products falling within the scope of this part of ISO 16634 (see 3.2).

If requested, the crude protein content, expressed as a percentage mass fraction of the dry matter, w ,

can be calculated from Formula (3):
100w
w = (3)
100− w

where w is the moisture content, expressed as a percentage mass fraction, determined in

accordance with ISO 712, ISO 6540 or ISO 24557.
10.2 Expression of results

Express the result to the three significant figures (e.g. 9,53 % or 20,5 % or 35,4 %).

11 Precision
11.1 Interlaboratory tests

Details of interlaboratory tests carried out to determine the precision of the method are given in

Annex D.
6 © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 16634-2:2016(E)

The values derived from these interlaboratory tests may not be applicable to concentration ranges and

matrices other than those given, i.e. to nitrogen contents between 0,05 % and 13,89 %.

11.2 Repeatability

The absolute difference between two independent single test results, obtained using the same method

on identical test material in the same laboratory by the same operator using the same equipment within

a short interval of time, will not be greater than the repeatability limit, r, given below in more than 5 %

of cases:
r = 2,8 s = 2,8 (0,001 3 w + 0,012) (4)
r N
where
s is the repeatability standard deviation;

w is the nitrogen content, expressed as a percentage mass fraction, of the sample at its natural

moisture content.
11.3 Reproducibility

The absolute difference between two single test results, obtained using the same method on identical

test material in different laboratories with different operators using different equipment, will not be

greater than the repeatability limit, R, given below in more than 5 % of cases:
R = 2,8 s = 2,8 (0,012 6 w + 0,017) (5)
R N
where
s is the reproducibility standard deviation;
w is the nitrogen content, expressed as a percentage mass fraction.
11.4 Critical difference
11.4.1 Comparison of two groups of measurements in the same laboratory

The critical difference, CD, i.e. the difference between two averaged values obtained from two test

results under repeatability conditions, is given by Formula (6).
1 1 1
CD=+28,,s ==28ss19, 8 (6)
rr r
2nn2 2
where
s is the repeatability standard deviation;

n and n are the number of test results corresponding to each of the averaged values.

1 2
© ISO 2016 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 16634-2:2016(E)
11.4.2 Comparison of two groups of measurements in two different laboratories

The critical difference between two averaged values obtained in two different laboratories from two

test results under repeatability conditions is equal t
...

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 16634-2
ISO/TC 34/SC 4 Secretariat: SAC
Voting begins on: Voting terminates on:
2014-10-02 2015-03-02
Food products — Determination of the total nitrogen
content by combustion according to the Dumas principle
and calculation of the crude protein content —
Part 2:
Cereals, pulses and milled cereal products

Produits alimentaires — Détermination de la teneur en azote total par combustion selon le principe Dumas

et calcul de la teneur en protéines brutes —
Partie 2: Céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture
ICS: 67.060;67.050
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft has been developed within the International Organization for
Standardization (ISO), and processed under the ISO lead mode of collaboration
as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member
bodies for a parallel five month enquiry.

Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments

received, will be submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and
THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED
formal vote in CEN.
FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
committee secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
composition will be undertaken at publication stage.
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 16634-2:2014(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2014
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ISO/DIS 16634-2:2014(E)
Copyright notice

This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as

permitted under the applicable laws of the user’s country, neither this ISO draft nor any extract

from it may be reproduced, stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means,

electronic, photocopying, recording or otherwise, without prior written permission being secured.

Requests for permission to reproduce should be addressed to either ISO at the address below or ISO’s

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ii © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO/DIS 16634-2
Contents Page

Foreword ...........................................................................................................................................................................5

Introduction .....................................................................................................................................................................6

1 Scope ....................................................................................................................................................................1

2 Normative references ....................................................................................................................................1

3 Terms and definitions ....................................................................................................................................1

4 Principle ..............................................................................................................................................................2

5 Reagents ..............................................................................................................................................................2

6 Apparatus ...........................................................................................................................................................3

7 Sampling .............................................................................................................................................................4

8 Preparation of test sample ...........................................................................................................................4

9 Procedure ...........................................................................................................................................................4

9.1 General ................................................................................................................................................................4

9.2 Test portion .......................................................................................................................................................4

9.3 Control of oxygen supply ..............................................................................................................................5

9.4 Calibration ..........................................................................................................................................................5

9.5 Determination...................................................................................................................................................5

9.6 Detection and integration .............................................................................................................................7

10 Calculation and expression of results ......................................................................................................7

10.1 Calculation..........................................................................................................................................................7

10.2 Expression of results ......................................................................................................................................8

11 Precision .............................................................................................................................................................8

11.1 Interlaboratory tests ......................................................................................................................................8

11.2 Repeatability .....................................................................................................................................................8

11.3 Reproducibility .................................................................................................................................................8

11.4 Critical difference ............................................................................................................................................8

11.5 Uncertainty ........................................................................................................................................................9

12 Test report .........................................................................................................................................................9

Annex A (informative) Flowchart for a basic Dumas apparatus ............................................................... 10

Annex B (informative) Schematic diagrams of suitable types of Dumas apparatus .......................... 11

Annex C (informative) Equipment calibration ................................................................................................ 14

C.1 Calibration compounds .............................................................................................................................. 14

C.2 Examples for calculation of the estimated oxygen demand .......................................................... 14

Annex D (informative) Examples of factors for converting nitrogen content to protein

content .............................................................................................................................................................. 16

Annex E (informative) Results of interlaboratory tests ............................................................................... 17

E.1 General ............................................................................................................................................................. 17

E.2 Precision data for nitrogen content ....................................................................................................... 17

E.3 Precision data for protein content ......................................................................................................... 20

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ISO/DIS 16634-2

Bibliography ................................................................................................................................................................. 24

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ISO/DIS 16634-2
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national

standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally

carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a

technical committee has been established has the right to be represented on that committee.

International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in

the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all

matters of electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2. www.iso.org/directives

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received. www.iso.org/patents

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO's adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 4, cereals

and pulse.

This second edition cancels and replaces the first edition, which has been technically revised.

© ISO 2013 – All rights reserved v
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ISO/DIS 16634-2
Introduction

For a long time, the Kjeldahl method has been the most frequently used method for the determination

of the protein content of food products. However, in recent years, the Kjeldahl method has increasingly

been replaced by the Dumas method, which is faster and does not use dangerous chemicals. Although

the principles of the two methods are different, both measure the nitrogen content of the product.

Nitrogen content can be converted into protein content by using an appropriate factor. The value of this

factor varies depending on the relative amounts of different proteins and their amino-acid composition

in a given product.

Neither the Dumas nor the Kjeldahl method distinguishes between protein and non-protein nitrogen. In

most cases, results obtained by the Dumas method are slightly higher than those of the Kjeldahl method.

This is due to the fact that the Dumas method measures almost all of the non-protein nitrogen, whereas

the Kjeldahl method measures only a part of it.

Taking into consideration the fact that the protein content of a product calculated by both methods only

approximates to the true value, it is a matter of discretion which one is accepted. The most appropriate

solution should be the use of a second factor for the elimination of the systematic error caused by the

non-protein nitrogen content of the different products. However, this second factor has to be

determined for each product, like the existing factors which indicate the ratio of the protein content to

the nitrogen content.
vi © ISO 2013 – All rights reserved
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DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 16634-2
Food products — Determination of the total nitrogen content by
combustion according to the Dumas principle and calculation of
the crude protein content —
Part 2:
Cereals, pulses and milled cereal products
1 Scope

This part of ISO 16634 specifies a method for the determination of the total nitrogen content and the

calculation of the crude protein content of cereals, pulses and milled cereal products.

This method, like the Kjeldahl method (see References [1] and [6]), does not distinguish between

protein nitrogen and non-protein nitrogen. For the calculation of the protein content, various

conversion factors are used (see Annex D).
2 Normative references

The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated

references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced

document (including any amendments) applies.

ISO 712, Cereals and cereal products — Determination of moisture content — Reference method

ISO 6540, Maize — Determination of moisture content (on milled grains and on whole grains)

ISO 24557, Pulses — Determination of moisture content — Air-oven method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
nitrogen content

mass fraction of the total nitrogen determined by the procedure specified in this part of ISO 16634

NOTE The mass fraction is expressed as a percentage.
3.2
crude protein content

nitrogen content (3.1) multiplied by a factor, usually 5,7 for wheat, rye and their milled products and

6,25 for others products falling within the scope of this part of ISO 16634

NOTE The factors for calculation of the crude protein content from the total nitrogen content are derived

from the Kjeldahl method, which is the reference method for the determination of total nitrogen content. As the

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ISO/DIS 16634-2

method specified in this part of ISO 16634 uses the same factors as the Kjeldahl method, the validity of these

factors has to be verified due to the slight difference in the results obtained with the Kjeldahl and Dumas methods.

4 Principle

Samples are converted to gases by heating in a combustion tube. Interfering components are removed

from the resulting gas mixture. The nitrogen compounds in the gas mixture, or a representative part of

them, are converted to molecular nitrogen which is quantitatively determined by a thermal-

conductivity detector. The nitrogen content is then calculated by a microprocessor.

5 Reagents

Use only reagents of recognized analytical grade or reagents of equivalent purity as specified by

instrument manufacturers. Except for the reference materials (see 5.12), all reagents shall be free from

nitrogen.
5.1 Carrier gas(es): use either 5.1.1 or 5.1.2.

5.1.1 Carbon dioxide, as pure as possible, but with a minimum CO volume fraction of 99,99 %.

5.1.2 Helium, as pure as possible, but with a minimum He volume fraction of 99,99 %.

5.2 Oxygen, as pure as possible, but with a minimum O volume fraction of 99,99 %.

5.3 Sulfur dioxide and halogen absorbent, to eliminate any sulfur from the sample [e.g. lead

chromate (PbCrO ) or steel wool].
5.4 Copper oxide/platinum catalyst, for the post-combustion tube.

Platinum catalyst [5 % of Pt on alumina (Al O )] is blended with CuO in the ratio 1 part:7 parts or

2 3
1 part:8 parts in accordance with the manufacturer's recommendations.

To prevent separation as a result of the different bulk densities of the two materials, it is recommended

not to prepare the mixture before filling the tube but to pour the platinum catalyst and copper oxide

simultaneously into the post-combustion tube using a suitable funnel.
5.5 Silver or copper wool.

This shall be disaggregated before being inserted into the post-combustion or reduction tube.

5.6 Silica (quartz) or glass wool or cotton wool, as recommended by the instrument manufacturer.

5.7 Copper or tungsten (wire, cuttings, turnings or powder), for the reduction tube.

The use of copper or tungsten in one of these forms can improve the precision of analytical results for

samples with low nitrogen contents (about 1 % mass fraction).

5.8 Diphosphorus pentoxide (P O ) or granulated magnesium perchlorate [Mg(ClO ) ], or

2 5 4 2
another suitable drying agent, to fill the drying tubes.
5.9 Hollow corundum spheres or aluminium oxide pellets, for the combustion tube.
5.10 Copper oxide (CuO), as filling material for the combustion tube.
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ISO/DIS 16634-2
5.11 Sodium hydroxide (NaOH), on a support material.

5.12 Aspartic acid (C H NO ) or ethylenediaminetetraacetic acid (C H N O ) or glutamic acid

4 7 4 10 16 2 8

(C H NO ) or hippuric acid (C H NO ) standard, or other suitable reference materials with a known,

5 9 4 9 9 3
constant, certified nitrogen content.
The minimum recovery should preferably be 99 % mass fraction.

5.13 Light petroleum, with a boiling range between 30 °C and 60 °C, or acetone or ethanol.

6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following:
6.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 1 g.
6.2 Grinding device, appropriate to the nature of the sample.
6.3 Sieve, of nominal opening size 800 µm or 1 mm, made of non-ferrous material.

6.4 Crucibles (e.g. made of stainless steel, quartz, ceramic material or platinum) or tin capsules or

nitrogen-free filter paper, suitable for the Dumas apparatus used.

NOTE 1 Several instruments provided with an automatic sampler are commercially available.

NOTE 2 Some solid samples (e.g. powders) can be pressed to form pellets.

6.5 Dumas apparatus , fitted with a furnace able to maintain a given temperature greater than or

equal to 850 °C, with a thermal-conductivity detector and suitable device for signal integration.

Suitable Dumas apparatus operates according to the general flowchart given in Annex A, although

different arrangements and components may be used.

NOTE Schematic diagrams of three commercially available instruments are shown as examples in Figures B.1,

B.2 and B.3.

To avoid leaks, the sealing O-rings shall be slightly lubricated with high-vacuum grease prior to

installation.

Experience has shown that it is important to clean all pieces of silicaware and glassware carefully and to

remove fingerprints from tubes, using a suitable solvent (e.g. acetone), before inserting them in the

furnace.

Elementar Analysensysteme, Sumika Chemical Analysis Service and LECO Instruments produce suitable equipment

available commercially. This information is given for the convenience of users of this Technical Specification and does not

constitute an endorsement by ISO of this equipment. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same

results.
© ISO 2013 – All rights reserved 3
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ISO/DIS 16634-2
7 Sampling

A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or

changed during transport or storage.

Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 16634. Recommended sampling methods

[7]
are given in ISO 24333 for cereals and cereal products.
8 Preparation of test sample

The test sample shall be prepared from the laboratory sample in such a way that a homogeneous test

sample is obtained.

Using a suitable grinding device (6.2), grind the laboratory sample. Generally, pass the ground material

through a sieve (6.3) of nominal opening size 800 µm for small sample sizes (under 300 mg) or a sieve

of nominal opening size 1 mm for larger sample sizes (300 mg or more). Mills that produce particle

sizes meeting the specifications given in Table 1 will give acceptable results.
Table 1 — Required particle size
Nominal size of sieve openings Amount passing through sieve
µm % mass fraction
710 100
500 95 to 100
200 85 or less

Grinding may result in moisture loss and therefore the moisture content of the ground sample should

preferably also be determined when reporting nitrogen or protein contents on a dry-matter or

constant-moisture basis. Determination of the moisture content shall be carried out in accordance with

ISO 712 for cereals other than maize, ISO 6540 for maize and ISO 24557 for pulses.

The grinder efficiency can be checked by replicate preparation of ground samples of a 21 mixture of

maize and soya seeds. The expected coefficient of variation should be less than 2 % mass fraction.

9 Procedure
9.1 General

Carefully follow the manufacturer's instructions for instrument set-up, optimization, calibration and

operation. Switch the instrument on and allow it to stabilize as defined in local procedures.

An instrument performance test should be carried out daily, using the reference material (5.12). The

recovery of nitrogen should be  99,0 % mass fraction.
9.2 Test portion

Weigh, to the nearest 0,000 1 g, at least 0,1 g of the test sample into a crucible or tin capsule or

nitrogen-free filter paper (6.4). For samples low in protein ( 1 % mass fraction), the amount of the test

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ISO/DIS 16634-2

portion can be increased up to 3,5 g, depending on the type of Dumas equipment being used and on the

nature of the sample.

Depending on the type of equipment used, if the sample contains over 17 % mass fraction of moisture, it

may be necessary to dry it before analysis.

Lower masses may be necessary for very high protein content samples or when only very small

amounts of sample are available. In the case of masses less than 0,1 g, a second (validation)

determination shall be performed.
9.3 Control of oxygen supply

Control the oxygen supply, in particular the flow, in accordance with the instructions of the material

supplier.

With each series of nitrogen content determinations, conduct as many blank runs as necessary to

stabilize the equipment, using for each run an equivalent mass of sucrose in place of the test portion.

The sucrose blank provides the amount of nitrogen that is introduced in the form of atmospheric air

trapped within a powdered organic material. Use the mean value of the blank determinations as an

error correction in the calculation of the nitrogen content of each test sample.
9.4 Calibration

For long-term instrument calibration, use pure compounds with a known, constant nitrogen content, e.g.

aspartic acid (see 5.12), as standards. Analyse in duplicate three pure compounds, each in three

different amounts chosen as a function of the measurement range for the actual samples.

To prepare a calibration curve, carry out at least five determinations with different amounts of the same

compound, choosing the compound and the amounts used in such a way that the curve obtained will

cover the range of nitrogen contents in the samples to be analysed.

If the test portion contains more than 200 mg of nitrogen, the calibration curve is likely to be non-linear.

In the non-linear section, short segments can nevertheless be used for calibration purposes. To ensure

the reliability of the curve in these segments, the amount of standard used shall be increased in steps

corresponding to 1 mg to 5 mg of nitrogen over the segments.
Calibration can also be performed using standard aqueous solutions.

Check the calibration at least three times at the beginning of a series of analyses and then after every 15

to 25 samples, analysing either one of the standards (see 5.12) or a sample of known value. The value

obtained for the nitrogen mass fraction shall differ by less than 0,05 % from the expected value. If it

does not, repeat the calibration check after checking instrument performance.
9.5 Determination

With the instrument operating in the stable state, introduce the test portion in accordance with the

manufacturer's instructions.

During the analysis, the following processes take place in the instrument (see Figure B.1, B.2 or B.3).

The test portion is quantitatively combusted under standard conditions at a temperature of at least

850 °C, depending on the instrument and the material being analysed.
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ISO/DIS 16634-2

Volatile decomposition products (mainly molecular nitrogen, nitrogen oxides, carbon dioxide and water

vapour) are transported by the carrier gas (see 5.1) through the instrument.

Nitrogen oxides are reduced to molecular nitrogen, and the excess oxygen is bound to the copper or

tungsten (5.7) in the reduction column.

Water is removed by drying tubes filled with magnesium perchlorate, diphosphorus pentoxide or

another drying agent (see 5.8). If carbon dioxide is used as the carrier gas (see 5.1.1), it is removed by

being passed over a suitable absorbent, e.g. sodium hydroxide (5.11) on a suitable support material.

Interfering compounds (e.g. volatile halogen and sulfur compounds) are removed by absorbents (5.3)

or chemical reagents, e.g. silver wool (5.5) or sodium hydroxide (5.11) on a suitable support material.

The remaining gas mixture, consisting of nitrogen and carrier gas, is passed through a thermal-

conductivity detector.
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ISO/DIS 16634-2
9.6 Detection and integration

For quantitative nitrogen determination, the instrument uses a sensitive thermal-conductivity cell that

is optimized for the carrier gas employed and that may have automatic zero adjustment between

measurements on successive test portions. After amplification and analogue/digital conversion of the

detector signal, the data obtained are processed by peripheral microprocessor hardware.

10 Calculation and expression of results
10.1 Calculation
10.1.1 Nitrogen content

The results for the total nitrogen content, w , expressed as a percentage mass fraction, are usually

available in the form of instrument printouts.
10.1.2 Crude protein content
The correction factor, F , is obtained from Equation (1):
100 w
H O, 1
F  (1)
100 w
H O, 2
where
w is the moisture mass fraction, expressed as a percentage, before grinding;
H O,1
w is the moisture mass fraction, expressed as a percentage, after grinding.
H O,2

The crude protein content, w , expressed as a percentage mass fraction, is obtained from Equation (2):

w  w F F (2)
p N c
where

w is the nitrogen content, expressed as a percentage mass fraction, of the sample at its natural

moisture content;

F is the generally agreed conversion factor for the product analysed, equal to 5,7 for wheat, rye

and their milled products and 6,25 for other products falling within the scope of this part of

ISO 16634 (see Annex D).

If requested, the crude protein content expressed as a percentage mass fraction of the dry matter, w ,

can be calculated from Equation (3):
100w
w 
(3)
100 w

where w is the moisture content, expressed as a percentage mass fraction, determined in accordance

H O
with ISO 712, ISO 6540 or ISO 24557.
© ISO 2013 – All rights reserved 7
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ISO/DIS 16634-2
10.2 Expression of results

Express the result to three significant figures (e.g. 9,53 % or 20,5 % or 35,4 %).

11 Precision
11.1 Interlaboratory tests

Details of interlaboratory tests carried out to determine the precision of the method are given in

Annex E.

The values derived from these interlaboratory tests may not be applicable to concentration ranges and

matrices other than those given, i.e. to nitrogen contents between 0,05 % and 13,89 %.

11.2 Repeatability

The absolute difference between two independent single test results, obtained using the same method

on identical test material in the same laboratory by the same operator using the same equipment within

a short interval of time, will not be greater than the repeatability limit, r, given below in more than 5 %

of cases:
r  2,8s  2,8(0,001 3w  0,012)
r N
where
s is the repeatability standard deviation;
w is the nitrogen content, expressed as a percentage mass fraction.
11.3 Reproducibility

The absolute difference between two single test results, obtained using the same method on identical

test material in different laborat
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16634-2
Première édition
2016-05-15
Produits alimentaires —
Détermination de la teneur en azote
total par combustion selon le principe
Dumas et calcul de la teneur en
protéines brutes —
Partie 2:
Céréales, légumineuses et produits
céréaliers de mouture
Food products — Determination of the total nitrogen content by
combustion according to the Dumas principle and calculation of the
crude protein content —
Part 2: Cereals, pulses and milled cereal products
Numéro de référence
ISO 16634-2:2016(F)
ISO 2016
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ISO 16634-2:2016(F)
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 16634-2:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 3

8 Préparation de l’échantillon pour essai ....................................................................................................................................... 4

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 4

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

9.2 Prise d’essai ............................................................................................................................................................................................... 4

9.3 Contrôle de l’alimentation en oxygène ............................................................................................................................... 5

9.4 Étalonnage .................................................................................................................................................................................................. 5

9.5 Détermination ......................................................................................................................................................................................... 5

9.6 Détection et traitement des données ................................................................................................................................... 6

10 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................................................................... 6

10.1 Calcul ............................................................................................................................................................................................................... 6

10.1.1 Teneur en azote ................................................................................................................................................................. 6

10.1.2 Teneur en protéines brutes .................................................................................................................................... 6

10.2 Expression des résultats ................................................................................................................................................................. 7

11 Fidélité ............................................................................................................................................................................................................................ 7

11.1 Essais interlaboratoires ......... .......................................................................................................................................................... 7

11.2 Répétabilité ................................................................................................................................................................................................ 7

11.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................... 7

11.4 Différence critique ............................................................................................................................................................................... 8

11.4.1 Comparaison de deux groupes de mesures dans un même laboratoire .......................... 8

11.4.2 Comparaison de deux groupes de mesures dans deux laboratoires ................................... 8

11.5 Incertitude .................................................................................................................................................................................................. 8

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 8

Annexe A (informative) Organigramme pour un appareil de Dumas de base .......................................................10

Annexe B (informative) Schémas de types d’appareils de Dumas appropriés ......................................................11

Annexe C (informative) Étalonnage du matériel ...................................................................................................................................14

Annexe D (informative) Résultats des essais interlaboratoires ............................................................................................16

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................23

© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16634-2:2016(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 4, Céréales et légumineuses.

Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 16634-2:2009, qui a fait l’objet d’une révision

technique.

L’ISO 16634 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Produits alimentaires —

Détermination de la teneur en azote total par combustion selon le principe Dumas et calcul de la teneur en

protéines brutes:
— Partie 1: Graines oléagineuses et aliments des animaux
— Partie 2: Céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 16634-2:2016(F)
Introduction

Longtemps, la méthode de Kjeldahl a été la méthode la plus fréquemment utilisée pour déterminer la

teneur en protéines des produits alimentaires. Ces dernières années, la méthode de Dumas a gagné en

importance par rapport à la méthode de Kjeldahl; plus rapide, la méthode de Dumas n’utilise en outre

aucun produit chimique dangereux. En dépit de principes différents, les deux méthodes mesurent la

teneur en azote du produit. Il est possible de convertir la teneur en azote pour obtenir la teneur en

protéines en utilisant un facteur approprié. La valeur de ce facteur varie en fonction des quantités

relatives des différentes protéines et de la composition en acides aminés de ces dernières dans un

produit donné.

Ni la méthode de Dumas ni la méthode de Kjeldahl ne distinguent l’azote protéique de l’azote non

protéique. Dans la plupart des cas, les résultats obtenus avec la méthode de Dumas sont légèrement

supérieurs à ceux produits par la méthode de Kjeldahl. En effet, la méthode de Dumas mesure presque

tout l’azote non protéique alors que la méthode de Kjeldahl n’en mesure qu’une partie.

Compte tenu du fait que la teneur en protéines d’un produit calculée à l’aide des deux méthodes ne fait

que se rapprocher de la vraie valeur, il est nécessaire de décider laquelle est acceptée. La solution la plus

appropriée doit consister à utiliser un second facteur afin d’éliminer l’erreur systématique causée par la

teneur en azote non protéique des différents produits. Cependant, il faut déterminer ce second facteur

pour chaque produit, tout comme les facteurs existants qui présentent le rapport entre la teneur en

protéines et la teneur en azote.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16634-2:2016(F)
Produits alimentaires — Détermination de la teneur en
azote total par combustion selon le principe Dumas et
calcul de la teneur en protéines brutes —
Partie 2:
Céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture
1 Domaine d’application

La présente partie de l’ISO 16634 spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en azote

total et le calcul de la teneur en protéines brutes des céréales, légumineuses et produits céréaliers de

mouture.

Cette méthode, comme la méthode de Kjeldahl (voir Références [1] et [6]), ne distingue pas l’azote

protéique de l’azote non protéique. Divers facteurs de conversion sont utilisés pour le calcul de la teneur

en protéines (voir 3.2).
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 712, Céréales et produits céréaliers — Détermination de la teneur en eau — Méthode de référence

ISO 6540, Maïs — Détermination de la teneur en eau (sur grains broyés et sur grains entiers)

ISO 24557, Légumineuses — Détermination de la teneur en eau — Méthode par séchage à l’étuve

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

3.1
teneur en azote
fraction massique de l’azote total

Note 1 à l’article: Déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente partie de l’ISO 16634.

Note 2 à l’article: La fraction massique est exprimée en pourcentage.
3.2
teneur en protéines brutes
teneur en azote (3.1) multipliée par un facteur

Note 1 à l’article: On utilise généralement un facteur égal à 5,7 pour les produits destinés à l’alimentation humaine

(tels que le blé, le seigle et leurs produits de mouture), et un facteur égal et à 6,25 pour l’orge de brasserie et

les céréales destinées à l’alimentation animale et les autres produits relevant du domaine d’application de la

présente partie de l’ISO 16634.
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ISO 16634-2:2016(F)

Note 2 à l’article: Les facteurs utilisés pour calculer la teneur en protéines brutes à partir de la teneur en azote

total sont dérivés de la méthode de Kjeldahl, qui est la méthode de référence pour la détermination de la teneur

en azote total.
4 Principe

Les échantillons sont transformés en gaz par chauffage dans un tube de combustion. Les composants

interférents sont éliminés du mélange gazeux obtenu. Les composés azotés du mélange gazeux, ou

une partie représentative de ces composés, sont transformés en azote moléculaire, qui est déterminé

quantitativement au moyen d’un détecteur à conductivité thermique. La teneur en azote de l’échantillon

est ensuite calculée par un système informatique.
5 Réactifs

Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ou des réactifs d’une pureté équivalente

selon les spécifications des fabricants d’appareils. À l’exception des matériaux de référence (5.12), aucun

réactif ne doit contenir d’azote.

5.1 Gaz vecteur(s), utiliser le gaz spécifié en 5.1.1 ou le gaz spécifié en 5.1.2.

5.1.1 Dioxyde de carbone, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale de CO de

99,99 %.

5.1.2 Hélium, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale de He de 99,99 %.

5.2 Oxygène, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale de O de 99,99 %.

5.3 Produit absorbant le dioxyde de soufre et les halogènes, afin d’éliminer toute trace de

composés soufrés de l’échantillon [par exemple, chromate de plomb (PbCrO ) ou laine d’acier].

5.4 Oxyde de cuivre/catalyseur au platine, pour le tube de postcombustion.

Le catalyseur au platine [5 % de platine (Pt) sur alumine (Al O )] est mélangé à de l’oxyde de cuivre (CuO)

2 3
dans un rapport de 1:7 ou de 1:8, conformément aux recommandations du fabricant.

Afin d’éviter la séparation de ces deux matériaux en raison de leurs masses volumiques en vrac

différentes, il est recommandé de ne pas préparer le mélange avant de remplir le tube mais de verser

simultanément le catalyseur au platine et l’oxyde de cuivre dans le tube de postcombustion, en utilisant

un entonnoir adapté.
5.5 Laine d’argent ou de cuivre.

La laine d’argent ou de cuivre doit être désagrégée avant d’être introduite dans le tube de postcombustion

ou de réduction.

5.6 Laine de silice (quartz) ou de verre ou ouate, selon les recommandations du fabricant

d’appareils.

5.7 Cuivre ou tungstène (fils, copeaux, tournures ou poudre), pour le tube de réduction.

L’utilisation de cuivre ou de tungstène sous l’une de ces formes peut améliorer la fidélité des résultats

analytiques dans le cas d’échantillons à faibles teneurs en azote (fraction massique de 1 % environ).

5.8 Pentoxyde de diphosphore (P O ), perchlorate de magnésium en granulés [Mg(ClO ) ], ou

2 5 4 2
autre agent déshydratant approprié, afin de remplir les tubes de déshydratation.
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ISO 16634-2:2016(F)

5.9 Sphères creuses de corindon ou pastilles d’oxyde d’aluminium, pour le tube de combustion.

5.10 Oxyde de cuivre (CuO), comme matériau de remplissage du tube de combustion.
5.11 Hydroxyde de sodium (NaOH), sur un matériau de support.

5.12 Composés étalons, par exemple acide aspartique (C H NO ), acide éthylène diamine

4 7 4

tétraacétique (C H N O ), acide glutamique (C H NO ) ou acide hippurique (C H NO ), ou

10 16 2 8 5 9 4 9 9 3

autres matériaux de référence appropriés de teneur en azote certifiée, connue et constante.

Il convient que le dosage minimal soit de 99 % en fraction massique.

5.13 Éther de pétrole, dont le point d’ébullition est compris entre 30 °C et 60 °C, ou acétone ou

éthanol.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit:
6.1 Balance analytique, permettant des pesées à 0,000 1 g près.
6.2 Broyeur, adapté à la nature de l’échantillon.

6.3 Tamis, fabriqué dans un matériau non ferreux et de dimension nominale d’ouverture de 800 µm

ou de 1 mm.

6.4 Creusets (par exemple, en acier inoxydable, en quartz, en céramique ou en platine), capsules

en étain, feuilles d’étain ou papier-filtre exempt d’azote, adaptés à l’appareil de Dumas utilisé.

NOTE 1 Un certain nombre d’appareils disponibles dans le commerce sont munis d’un échantillonneur

automatique.

NOTE 2 Certains échantillons sous forme solide (par exemple, des poudres) peuvent être agglomérés sous

forme de pastilles.

6.5 Appareil de Dumas, équipé d’un four capable de maintenir une température donnée supérieure ou

égale à 850 °C, d’un détecteur à conductivité thermique et d’un dispositif approprié d’intégration du signal.

Les appareils de Dumas adaptés fonctionnent selon le principe général donné dans l’Annexe A, bien que

plusieurs configurations et composants puissent être utilisés.

NOTE Les schémas correspondant à trois types d’appareils disponibles dans le commerce sont présentés, à

titre d’exemple, dans les Figures B.1 à B.3.

Afin d’éviter les fuites, il faut légèrement lubrifier les joints toriques utilisés pour assurer l’étanchéité

avec une graisse compatible avec un vide poussé avant de les mettre en place.

L’expérience a montré qu’il est important de nettoyer soigneusement tous les éléments en silice et en

verre, et d’ôter les traces de doigts sur les tubes au moyen d’un solvant approprié (5.13) avant de placer

ces derniers dans le four.
7 Échantillonnage

Il convient d’envoyer préalablement au laboratoire un échantillon représentatif. Il convient de ne pas

endommager ni modifier cet échantillon au cours du transport ou de l’entreposage.

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ISO 16634-2:2016(F)

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 16634. Des

méthodes d’échantillonnage recommandées sont données dans l’ISO 24333 pour les céréales et les

produits céréaliers.
8 Préparation de l’échantillon pour essai

Il faut préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon pour laboratoire de façon à obtenir un

échantillon pour essai homogène.

À l’aide d’un broyeur approprié (6.2), broyer l’échantillon pour laboratoire. Généralement, passer le

produit broyé sur un tamis (6.3) de dimension nominale d’ouverture de 800 µm pour les échantillons de

petite taille (inférieure à 300 mg) ou sur un tamis de dimension nominale d’ouverture de 1 mm pour les

échantillons de plus grande taille (300 mg ou plus). Les broyeurs qui produisent des particules dont la

taille répond aux spécifications du Tableau 1 donnent des résultats acceptables.
Tableau 1 — Taille de particules requise
Dimension nominale d’ouverture du
Quantité passant à travers le tamis
tamis
µm fraction massique en %
710 100
500 95 à 100
200 85 ou moins

Il peut résulter du broyage une perte de teneur en eau et, par conséquent, il convient de déterminer

également la teneur en eau de l’échantillon broyé lorsque les valeurs relatives à l’azote et aux protéines

sont rapportées à la matière sèche ou à une base constante de teneur en eau. La détermination de

la teneur en eau doit être réalisée conformément à l’ISO 712 pour les céréales autres que le maïs, à

l’ISO 6540 pour le maïs et à l’ISO 24557 pour les légumineuses.

Il est possible de vérifier l’efficacité du broyeur en préparant un échantillon en double d’un mélange

broyé de maïs et de graines de soja dans un rapport de 2 + 1. Il convient que le coefficient de variation

soit inférieur à 2 % en fraction massique.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités

Suivre attentivement les instructions du fabricant concernant l’installation, l’optimisation, l’étalonnage

et l’utilisation de l’appareil. Mettre l’appareil en position de marche et le laisser se stabiliser comme

défini dans les modes opératoires locaux.

Il convient de réaliser un essai de performance de l’appareil tous les jours, à l’aide du matériau de

référence (5.12). Il convient que le dosage d’azote soit supérieur à 99,0 % en fraction massique.

9.2 Prise d’essai

Peser, à 0,000 1 g près, au moins 0,1 g de l’échantillon pour essai dans un creuset ou une capsule en

étain ou du papier-filtre exempt d’azote (6.4). Pour les échantillons à faible teneur en protéines (fraction

massique inférieure à 1 %), la quantité de prise d’essai peut aller jusqu’à 3,5 g, selon le type d’appareil

de Dumas utilisé et la nature de l’échantillon.

En fonction du type de matériel utilisé, si l’échantillon contient une fraction massique de plus de 17 %

d’eau, il peut être nécessaire de le sécher avant l’analyse.
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ISO 16634-2:2016(F)

Des masses plus faibles peuvent être nécessaires dans le cas d’échantillons à très forte teneur en

protéines ou lorsque seules de très petites quantités d’échantillon sont disponibles. Dans le cas de

masses inférieures à 0,1 g, une deuxième détermination (validation) doit être réalisée.

9.3 Contrôle de l’alimentation en oxygène

Contrôler l’alimentation en oxygène, en particulier le débit, conformément aux instructions du fabricant

du matériel.

Pour chaque série de déterminations de la teneur en azote, réaliser autant de déterminations à blanc que

nécessaire pour stabiliser le matériel, en utilisant pour chacune une masse équivalente de saccharose à

la place de la prise d’essai. Le blanc à base de saccharose fournit la quantité d’azote qui est apportée par

l’air atmosphérique et qui est piégée dans une matière organique en poudre. Utiliser la valeur moyenne

des déterminations à blanc comme correction d’erreur dans le calcul de la teneur en azote de chaque

échantillon pour essai.
9.4 Étalonnage

Utiliser comme étalons des composés purs dont la teneur en azote est connue et constante, par exemple

l’acide aspartique (5.12), pour l’étalonnage de l’appareil. Effectuer deux analyses de trois composés

purs, chacun en trois quantités différentes, choisies selon la plage de mesures des échantillons réels.

Pour établir une courbe d’étalonnage, effectuer au moins cinq déterminations avec différentes quantités

du même composé et en quantités telles que la courbe obtenue couvre la plage des teneurs en azote des

échantillons à analyser.

Si la prise d’essai contient plus de 200 mg d’azote, la courbe d’étalonnage est théoriquement non linéaire.

Dans cette section non linéaire, il est néanmoins possible de réaliser l’étalonnage en utilisant plusieurs

segments de taille réduite. Afin de garantir la fiabilité de la courbe sur ces segments, il faut ajouter la

quantité d’étalon utilisée par paliers de 1 mg à 5 mg d’azote sur les segments.

L’étalonnage peut également être effectué à l’aide de solutions étalons aqueuses.

Vérifier l’étalonnage au moins trois fois au début d’une série d’analyses, puis tous les 15 à 25 échantillons,

en analysant soit l’un des étalons (5.12), soit un échantillon de valeur connue. La valeur obtenue pour la

fraction massique d’azote ne doit différer de la valeur théorique que de 0,05 % au plus. Si ce n’est pas le

cas, vérifier à nouveau l’étalonnage après avoir vérifié les performances de l’appareil.

9.5 Détermination

L’appareil étant en marche et stabilisé, introduire la prise d’essai conformément aux instructions du

fabricant.

Pendant l’analyse, les processus suivants se déroulent dans l’appareil (voir Figure B.1, B.2 ou B.3).

La prise d’essai est soumise à une combustion quantitative dans des conditions normalisées, à une

température minimale de 850 °C, en fonction de l’appareil et du matériau en cours d’analyse.

Les produits volatils issus de la décomposition (principalement azote moléculaire, oxydes d’azote,

dioxyde de carbone et eau) sont transportés par le gaz vecteur (5.1) à travers l’appareil.

Les oxydes d’azote sont réduits en azote moléculaire et l’oxygène en excès est retenu sur le cuivre ou le

tungstène (5.7) dans la colonne de réduction.

L’eau est éliminée au moyen de tubes de déshydratation remplis de perchlorate de magnésium, de

pentoxyde de diphosphore ou d’un autre agent de déshydratation (5.8). Si le dioxyde de carbone est

utilisé comme gaz vecteur (5.1.1), il est éliminé après passage sur un matériau absorbant approprié, par

exemple de l’hydroxyde de sodium (5.11) sur un matériau de support approprié.
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ISO 16634-2:2016(F)

Les composés interférents (par exemple, les gaz halogènes et les composés soufrés volatils) sont

éliminés au moyen de matériaux absorbants (5.3) ou de réactifs chimiques, par exemple de la laine

d’argent (5.5) ou de l’hydroxyde de sodium (5.11) sur un matériau de support approprié.

Le mélange gazeux résiduel, contenant l’azote et le gaz vecteur, est acheminé à travers un détecteur à

conductivité thermique.
9.6 Détection et traitement des données

Une cellule à conductivité thermique sensible, optimisée pour le gaz vecteur employé et pouvant être

munie d’un système de mise à zéro automatique entre les mesurages des prises d’essai individuelles,

est utilisée pour la détermination quantitative de l’azote. Après amplification et conversion

analogique/numérique du signal fourni par le détecteur, les données obtenues sont traitées par un

ordinateur périphérique.
10 Calcul et expression des résultats
10.1 Calcul
10.1.1 Teneur en azote

Les résultats indiquant la teneur en azote total, w , en fraction massique, exprimée en pourcentage,

sont généralement fournis par les sorties sur imprimante des appareils.
10.1.2 Teneur en protéines brutes
Le facteur de correction, F , est obtenu à l’aide de l’Équation (1):
100−w
HO,1
F = (1)
100 −w
HO,2
est la fraction massique d’eau, exprimée en pourcentage, avant broyage;
HO,1
est la fraction massique d’eau, exprimée en pourcentage, après broyage.
HO,2

La teneur en protéines brutes, w , en fraction massique, exprimée en pourcentage, est obtenue à l’aide

de l’Équation (2):
w = w F F (2)
p N c

w est la teneur en azote, en fraction massique, exprimée en pourcentage, de l’échantillon à sa

teneur en eau naturelle;

F est le facteur de conversion généralement reconnu pour le produit analysé, égal à 5,7 pour

les céréales destinées à l’alimentation humaine (telles que le blé, le seigle et leurs produits de

mouture), et à 6,25 pour l’orge de brasserie et les céréales destinées à l’ali
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 16634-2
ISO/TC 34/SC 4 Secrétariat: SAC
Début de vote: Vote clos le:
2014-10-02 2015-03-02
Produits alimentaires — Détermination de la teneur en
azote total par combustion selon le principe Dumas et
calcul de la teneur en protéines brutes —
Partie 2:
Céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture

Food products — Determination of the total nitrogen content by combustion according to the Dumas

principle and calculation of the crude protein content —
Part 2: Cereals, pulses and milled cereal products
ICS: 67.060;67.050
TRAITEMENT PARRALLÈLE ISO/CEN

Le présent projet a été élaboré dans le cadre de l’Organisation internationale de

normalisation (ISO) et soumis selon le mode de collaboration sous la direction
de l’ISO, tel que défini dans l’Accord de Vienne.
Le projet est par conséquent soumis en parallèle aux comités membres de l’ISO et
aux comités membres du CEN pour enquête de cinq mois.

En cas d’acceptation de ce projet, un projet final, établi sur la base des observations

CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR

OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC reçues, sera soumis en parallèle à un vote d’approbation de deux mois au sein de

SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
l’ISO et à un vote formel au sein du CEN.
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu’il est
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
parvenu du secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
texte sera effectué au Secrétariat central de l’ISO au stade de publication.
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 16634-2:2014(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2014
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ISO/DIS 16634-2:2014(F)
Notice de droit d’auteur

Ce document de l’ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d’auteur

de l’ISO. Sauf autorisé par les lois en matière de droits d’auteur du pays utilisateur, aucune partie de

ce projet ISO ne peut être reproduite, enregistrée dans un système d’extraction ou transmise sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie,

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ISO/DIS 16634-2
Sommaire Page

Avant-propos ..................................................................................................................................................... iv

Introduction ......................................................................................................................................................... v

1 Domaine d'application .......................................................................................................................... 1

2 Références normatives ......................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ............................................................................................................................ 1

4 Principe .................................................................................................................................................. 2

5 Réactifs ................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage ........................................................................................................................................... 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................... 3

8 Préparation de l'échantillon pour essai .............................................................................................. 4

9 Mode opératoire ..................................................................................................................................... 4

9.1 Généralités ............................................................................................................................................. 4

9.2 Prise d’essai ........................................................................................................................................... 4

9.3 Contrôle de l'alimentation en oxygène................................................................................................ 5

9.4 Étalonnage ............................................................................................................................................. 5

9.5 Détermination ........................................................................................................................................ 5

9.6 Détection et intégration ........................................................................................................................ 6

10 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................... 6

10.1 Calcul ...................................................................................................................................................... 6

10.2 Expression des résultats ...................................................................................................................... 7

11 Fidélité .................................................................................................................................................... 7

11.1 Essais interlaboratoiress ...................................................................................................................... 7

11.2 Répétabilité ............................................................................................................................................ 7

11.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................... 7

11.4 Différence critique ................................................................................................................................. 7

11.5 Incertitude .............................................................................................................................................. 8

12 Rapport d'essai ...................................................................................................................................... 8

Annexe A (informative) Organigramme pour un appareil de Dumas de base ............................................... 9

Annexe B (informative) Schémas de types d'appareils de Dumas appropriés ........................................... 10

Annexe C (informative) Étalonnage du matériel ............................................................................................. 13

C.1 Composés d’étalonnage ..................................................................................................................... 13

C.2 Exemples pour le calcul de l’estimation de la demande d’oxygène .............................................. 13

Annexe D (informative) Exemples de facteurs de conversion pour obtenir la teneur en protéines à

partir de la teneur en azote ................................................................................................................. 15

Annexe E (informative) Résultats des essais interlaboratoires .................................................................... 16

E.1 Généralités ........................................................................................................................................... 16

E.2 Données de fidélité pour la teneur en azote ..................................................................................... 16

E.3 Données de fidélité pour la teneur en protéines .............................................................................. 19

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 23

© ISO 2014 – Tous droits réservés iii
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ISO/DIS 16634-2
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont décrites

dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents critères

d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été rédigé

conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet

de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour

responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails

concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés

lors de l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations

de brevets reçues par reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation

de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de l'ISO aux principes de l'OMC

concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : Avant‐propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l'élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité

SC 4, Céréales et légumineuses.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition qui a fait l'objet d'une révision technique.

iv © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16634-2
Introduction

Longtemps, la méthode Kjeldahl a été la méthode la plus fréquemment utilisée pour la détermination de la

teneur en protéines des produits alimentaires. Cependant, au cours des dernières années, elle a de plus en

plus souvent été remplacée par la méthode de Dumas qui est plus rapide et n'utilise pas de produits

chimiques dangereux. Bien que les principes des deux méthodes soient différents, toutes deux mesurent la

teneur en azote du produit. Il est possible de convertir la teneur en azote pour obtenir la teneur en protéines à

l'aide d'un facteur approprié. La valeur de ce facteur varie avec les quantités relatives des différentes

protéines et leur composition en acides aminés dans un produit donné.

Ni la méthode de Dumas ni la méthode Kjeldahl ne distinguent l'azote protéique de l'azote non protéique.

Dans la plupart des cas, les résultats obtenus avec la méthode de Dumas sont légèrement supérieurs à ceux

produits par la méthode Kjeldahl. En effet, la méthode de Dumas mesure presque tout l'azote non protéique

alors que la méthode Kjeldahl n'en mesure qu'une partie.

Compte tenu du fait que la teneur en protéines d'un produit calculée à l'aide des deux méthodes ne fait que se

rapprocher de la valeur vraie, il appartient de décider laquelle est acceptée. La solution la plus appropriée

consiste à utiliser un second facteur afin d'éliminer l'erreur systématique causée par la teneur en azote non

protéique des différents produits. Cependant, ce second facteur est à déterminer pour chaque produit, tout

comme les facteurs existants qui présentent le rapport de la teneur en protéines en fonction de la teneur en

azote.
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16634-2
Produits alimentaires – Détermination de la teneur en azote
total par combustion selon le principe Dumas et calcul de la
teneur en protéines brutes – Partie 2: Céréales, légumineuses
et produits céréaliers de mouture
1 Domaine d'application

La présente partie de l'ISO 16634 spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en azote total et le

calcul de la teneur en protéines brutes des céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture.

Cette méthode, comme la méthode Kjeldahl (voir Références [1] et [6]), ne distingue pas l'azote protéique de

l'azote non protéique. Divers facteurs de conversion sont utilisés pour le calcul de la teneur en protéines

(voir l'Annexe D).
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 712, Céréales et produits céréaliers — Détermination de la teneur en eau — Méthode de référence

ISO 6540, Maïs — Détermination de la teneur en eau (sur grains broyés et sur grains entiers)

ISO 24557, Légumineuses — Détermination de la teneur en eau — Méthode par séchage à l'étuve

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

3.1
teneur en azote

fraction massique de l'azote total, déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente partie de

l'ISO 16634
NOTE La fraction massique est exprimée en pourcentage.
3.2
teneur en protéines brutes

teneur en azote (3.1) multipliée par un facteur généralement égal à 5,7 pour le blé, le seigle et leurs produits

de mouture, et à 6,25 pour les autres produits relevant du domaine d'application de la présente partie de

l'ISO 16634

NOTE Les facteurs utilisés pour le calcul de la teneur en protéines brutes à partir de la teneur en azote total sont

dérivés de la méthode Kjeldahl qui est la méthode de référence pour la détermination de la teneur en azote total. Étant

donné que la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 16634 utilise les mêmes facteurs que la méthode

Kjeldahl, la validité de ces facteurs est à vérifier en raison de la légère différence des résultats obtenus avec les méthodes

Kjeldahl et Dumas.
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4 Principe

Les échantillons sont transformés en gaz par chauffage dans un tube à combustion. Les composants

interférents sont éliminés du mélange gazeux obtenu. Les composés azotés du mélange gazeux, ou une

partie représentative de ceux-ci, sont transformés en azote moléculaire, qui est déterminé quantitativement au

moyen d'un détecteur à conductivité thermique. La teneur en azote de l'échantillon est ensuite calculée par un

système informatique.
5 Réactifs

Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ou des réactifs d'une pureté équivalente selon

les spécifications des fabricants d'appareils. À l'exception des matériaux de référence (voir 5.12), aucun

réactif ne doit contenir de l’azote.
5.1 Gaz vecteur(s): utiliser l'un des gaz en 5.1.1 ou 5.1.2.

5.1.1 Dioxyde de carbone, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale de CO ≥ 99,99 %.

5.1.2 Hélium, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale de He ≥ 99,99 %.

5.2 Oxygène, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale de O ≥ 99,99 %.

5.3 Produit absorbant le dioxyde de soufre et les halogènes, afin d'éliminer toute trace de composés

soufrés de l'échantillon [par exemple chromate de plomb (PbCrO ) ou laine d'acier].

5.4 Catalyseur au platine et à l'oxyde de cuivre, pour le tube de postcombustion.

Le catalyseur au platine [5 % de platine (Pt) sur alumine (Al O )] est mélangé à de l'oxyde de cuivre (CuO)

2 3
dans un rapport de 1:7 ou 1:8, conformément aux recommandations du fabricant.

Afin d'éviter une séparation de ces deux matériaux en raison de leurs masses volumiques en vrac différentes,

il est recommandé de ne pas préparer le mélange avant de remplir le tube mais de verser simultanément le

catalyseur au platine et à l'oxyde de cuivre dans le tube de postcombustion, en utilisant un entonnoir adapté.

5.5 Laine d'argent ou de cuivre.

La laine d'argent ou de cuivre doit être désagrégée avant de l'introduire dans le tube de postcombustion ou de

réduction.

5.6 Silice (quartz) ou laine de verre ou ouate, selon ce qui est recommandé par le fabricant d'appareils.

5.7 Cuivre ou tungstène (fils, copeaux, tournures ou poudre), pour le tube de réduction.

L'utilisation de cuivre ou de tungstène sous l'une de ces formes peut améliorer la fidélité des résultats

analytiques dans le cas d'échantillons à faibles teneurs en azote (fraction massique de 1 % environ).

5.8 Pentoxyde de diphosphore (P O ) ou perchlorate de magnésium en granulés [Mg(ClO ) ] ou autre

2 5 4 2
agent déshydratant approprié, afin de remplir les tubes de déshydratation.

5.9 Sphères creuses de corindon ou pastilles d'oxyde d'aluminium, pour le tube de combustion.

5.10 Oxyde de cuivre (CuO), comme matériau pour le remplissage du tube de combustion.

5.11 Hydroxyde de sodium (NaOH), sur un matériau de support.
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5.12 Composés étalons, par exemple acide aspartique (C H NO) ou acide éthylènediamine

4 7 4

tétraacétique (C H N O ) ou acide glutamique (C H NO ) ou acide hippurique (C H NO ), ou autres

10 16 2 8 5 9 4 9 9 3

matériaux de référence appropriés de teneur en azote certifiée, connue et constante.

Il convient que le dosage minimal soit de 99 % en fraction massique.

5.13 Éther de pétrole, dont le point d'ébullition est compris entre 30 °C et 60 °C, ou acétone ou éthanol.

6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Balance analytique, permettant des pesées à 0,000 1 g près.
6.2 Broyeur, adapté à la nature de l'échantillon.

6.3 Tamis, fabriqué dans un matériau non ferreux et de dimension nominale d'ouverture de 800 µm ou

de 1 mm.

6.4 Creusets (par exemple en acier inoxydable, en quartz, en céramique ou en platine) ou capsules en

étain ou papier-filtre exempt d'azote, adaptés à l'appareil de Dumas utilisé.

NOTE 1 Un certain nombre d'appareils disponibles dans le commerce sont fournis avec un échantillonneur

automatique.

NOTE 2 Certains échantillons sous forme solide (par exemple des poudres) peuvent être agglomérés sous forme de

pastilles.

6.5 Appareil de Dumas , équipé d'un four capable de maintenir une température donnée supérieure ou

égale à 850 °C, d'un détecteur à conductivité thermique et d'un dispositif approprié d'intégration du signal.

Des types d'appareils de Dumas appropriés disponibles sur le marché fonctionnent selon le principe général

donné dans l'Annexe A, bien que plusieurs configurations et composants puissent être utilisés.

NOTE Les schémas correspondant à trois types d'appareils disponibles sont illustrés, à titre d'exemple, aux

Figures B.1, B.2 et B.3.

Afin d'éviter les fuites, les joints toriques utilisés pour assurer l'étanchéité doivent être légèrement lubrifiés

avec une graisse compatible avec un vide poussé avant d'être mis en place.

L'expérience a montré qu'il est important de nettoyer soigneusement toutes les pièces de silice et la verrerie,

et d'ôter les traces de doigts sur les tubes au moyen d'un solvant approprié (par exemple acétone) avant de

placer ces derniers dans le four.
7 Échantillonnage

Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé préalablement au laboratoire. Il convient qu’il n’ait pas

été endommagé ou modifié au cours du transport ou de l'entreposage.

L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 16634. Des

[7]

méthodes d'échantillonnage recommandées sont données dans l’ISO 24333 pour les céréales et produits

céréaliers.

Elementar Analysensysteme GmbH, Sumika Chemical Analysis Service, Ltd et LECO Instruments fabriquent des

appareils appropriés disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente

Spécification technique et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l‘emploi exclusif des appareils ainsi

désignés. Des appareils équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.

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8 Préparation de l'échantillon pour essai

L'échantillon pour essai doit être préparé à partir de l'échantillon pour laboratoire de façon à obtenir un

échantillon pour essai homogène.

Broyer l'échantillon de laboratoire à l'aide d'un broyeur approprié (6.2). Généralement, passer le produit broyé

sur un tamis (6.3) de dimension nominale d'ouverture de 800 µm pour les échantillons de petite taille

(inférieure à 300 mg) ou sur un tamis de dimension nominale d'ouverture de 1 mm pour les échantillons de

taille plus élevée (300 mg ou plus). Les broyeurs qui produisent des particules aux dimensions répondant aux

spécifications données dans le Tableau 1 donnent des résultats acceptables.
Tableau 1 — Taille de particules requise
Dimension nominale d'ouverture Quantité passant à travers le
du tamis tamis
µm fraction massique en %
710 100
500 95 à 100
200 85 ou moins

Il peut résulter du broyage une perte de teneur en eau et, par conséquent, il convient de déterminer

également la teneur en eau de l'échantillon broyé lorsque les valeurs relatives à l'azote et aux protéines sont

rapportées à la matière sèche ou à une base constante de teneur en eau. La détermination de la teneur en

eau doit être réalisée conformément à l'ISO 712 pour les céréales autres que le maïs, à l’ISO 6540 pour le

maïs et à l’ISO 24557 pour les légumineuses.

L'efficacité du broyeur peut être vérifiée en préparant un échantillon en double d'un mélange broyé de maïs et

de graines de soja dans un rapport de 21. Il convient que le coefficient de variation soit inférieur à 2 % en

fraction massique.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités

Suivre attentivement les instructions du fabricant concernant l'installation, l'optimisation, l'étalonnage et

l'utilisation de l'appareil. Mettre l'appareil en position de marche et le laisser se stabiliser comme défini dans

les modes opératoires locaux.

Il convient de réaliser un essai de performance de l'appareil tous les jours, à l'aide du matériau de référence

(5.12). Il convient que le dosage minimal d'azote soit  99,0 % en fraction massique.

9.2 Prise d’essai

Peser, à 0,000 1 g près, au moins 0,1 g de l'échantillon pour essai dans un creuset ou une capsule en étain

ou du papier-filtre exempt d'azote (6.4). Pour les échantillons à faible teneur en protéines (fraction

massique  1 %), la quantité de prise d'essai peut aller jusqu'à 3,5 g, selon le type d'appareil de Dumas utilisé

et la nature de l'échantillon.

En fonction du type de matériel utilisé, si l'échantillon contient une fraction massique de plus de 17 % d'eau, il

peut être nécessaire de le sécher avant l'analyse.

Des masses plus faibles peuvent être nécessaires dans le cas d'échantillons à très forte teneur en protéines

ou lorsque seules de très petites quantités d'échantillon sont disponibles. Dans le cas de masses inférieures

à 0,1 g, une deuxième détermination (validation) doit être réalisée.
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9.3 Contrôle de l'alimentation en oxygène

Contrôler l'alimentation en oxygène, en particulier le débit, conformément aux instructions du fabricant du

matériel.

Pour chaque série de déterminations de la teneur en azote, réaliser autant de déterminations à blanc que

nécessaire pour stabiliser le matériel, en utilisant pour chacune une masse équivalente de saccharose à la

place de la prise d'essai. Le blanc à base de saccharose fournit la quantité d'azote qui est apportée par l'air

atmosphérique et qui est piégée dans une matière organique en poudre. Utiliser la valeur moyenne des

déterminations à blanc comme une correction d'erreur dans le calcul de la détermination de la teneur en azote

de chaque échantillon pour essai.
9.4 Étalonnage

Utiliser comme étalons des composés purs dont la teneur en azote est connue et constante, par exemple

l'acide aspartique (5.12), pour l'étalonnage à long terme de l'appareil. Effectuer deux analyses de trois

composés purs, chacun en trois quantités différentes, choisies selon la plage de mesure des échantillons

réels.

Pour l'élaboration d'une courbe d'étalonnage, effectuer au moins cinq déterminations avec différentes

quantités du même composé et en quantités telles que la courbe obtenue couvre la plage des teneurs en

azote des échantillons à analyser.

Si la prise d'essai contient plus de 200 mg d'azote, la courbe d'étalonnage est théoriquement non linéaire.

Dans cette section non linéaire, l'étalonnage peut néanmoins être réalisé en utilisant plusieurs segments de

taille réduite. Afin de garantir la fiabilité de la courbe sur ces segments, la quantité d'étalon utilisée doit être

ajoutée par paliers de 1 mg à 5 mg d'azote sur les segments.

L'étalonnage peut également être effectué à l'aide de solutions étalons aqueuses.

Vérifier l'étalonnage au moins trois fois au début d'une série d'analyses, puis tous les 15 à 25 échantillons, en

analysant soit l'un des étalons (voir 5.12), soit un échantillon de valeur connue. La valeur obtenue pour la

fraction massique d'azote ne doit différer de la valeur théorique que de 0,05 % au plus. Si ce n'est pas le cas,

vérifier à nouveau l'étalonnage après avoir vérifié les performances de l'appareil.

9.5 Détermination

L'appareil étant en marche et stabilisé, introduire la prise d'essai conformément aux instructions du fabricant.

Pendant l'analyse, les processus suivants se déroulent dans l'appareil (voir les Figures B.1, B.2 ou B.3).

La prise d'essai est soumise à une combustion quantitative dans des conditions normalisées, à une

température minimale de 850 °C, en fonction de l'appareil et du matériau en cours d'analyse.

Les produits volatils issus de la décomposition (principalement azote moléculaire, oxydes d'azote, dioxyde de

carbone et eau) sont transportés par le gaz vecteur (voir 5.1) à travers l'appareil.

Les oxydes d'azote sont réduits en azote moléculaire et l'oxygène en excès est retenu sur le cuivre ou le

tungstène (5.7) dans la colonne de réduction.

L'eau est éliminée au moyen de tubes de déshydratation remplis de perchlorate de magnésium, de pentoxyde

de diphosphore ou d'un autre agent de déshydratation (voir 5.8). Si le dioxyde de carbone est utilisé comme

gaz vecteur (voir 5.1.1), il est éliminé après passage sur un matériau absorbant approprié, par exemple de

l'hydroxyde de sodium (5.11) sur un matériau de support approprié.

Les composés interférents (par exemple les gaz halogènes et les composés soufrés volatils) sont éliminés au

moyen de matériaux absorbants (5.3) ou de réactifs chimiques, par exemple de la laine d'argent (5.5) ou de

l'hydroxyde de sodium (5.11) sur un matériau de support approprié.
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ISO/DIS 16634-2

Le mélange gazeux résiduel, contenant l'azote et le gaz vecteur, est acheminé à travers un détecteur à

conductivité thermique.
9.6 Détection et intégration

Une cellule à conductivité thermique sensible, optimisée pour le gaz vecteur employé et pouvant être munie

d'un système de mise à zéro automatique entre les mesurages des prises d'essai individuelles, est utilisée

pour la détermination quantitative d'azote. Après amplification et conversion analogique/numérique du signal

fourni par le détecteur, les données obtenues sont traitées par un ordinateur périphérique.

10 Calcul et expression des résultats
10.1 Calcul
10.
...

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