ISO 29701:2010
(Main)Nanotechnologies — Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems — Limulus amebocyte lysate (LAL) test
Nanotechnologies — Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems — Limulus amebocyte lysate (LAL) test
ISO 29701:2010 describes the application of a test using Limulus amebocyte lysate (LAL) reagent for the evaluation of nanomaterials intended for cell-based in vitro biological test systems. The test is suitable for use with nanomaterial samples dispersed in aqueous media, e.g. water, serum or reaction medium, and to such media incubated with nanomaterials for an appropriate duration at 37 °C. ISO 29701:2010 is restricted to test samples for in vitro systems, but the methods can also be adapted to nanomaterials to be administered to animals by parenteral routes.
Nanotechnologies — Essai de détection d'endotoxines sur des échantillons de nanomatériaux pour des systèmes in vitro — Essai au lysat d'amébocytes de Limule (LAL)
L'ISO 29701:2010 décrit l'application d'un essai utilisant le réactif LAL (lysat d'amébocytes de limule) en vue d'évaluer des nanomatériaux destinés à des systèmes d'essai biologique sur cultures cellulaires in vitro. L'essai est approprié à une utilisation avec des échantillons de nanomatériaux dispersés dans un milieu aqueux, par exemple de l'eau, du sérum physiologique ou un milieu de réaction, ainsi qu'à des milieux incubés avec des nanomatériaux pendant un temps donné à 37 °C. L'ISO 29701:2010 est conçue pour des échantillons destinés à des systèmes in vitro, toutefois, les méthodes peuvent également être adaptées à des nanomatériaux étant administrés à des animaux par voies parentérales.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 29701
First edition
2010-09-15
Nanotechnologies — Endotoxin test on
nanomaterial samples for in vitro
systems — Limulus amebocyte lysate
(LAL) test
Nanotechnologies — Essai de détection d'endotoxines sur des
échantillons de nanomatériaux pour des systèmes in vitro — Essai au
lysat d'amébocyte de Limule (LAL)
Reference number
ISO 29701:2010(E)
©
ISO 2010
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ISO 29701:2010(E)
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Published in Switzerland
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ISO 29701:2010(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Terms and definitions .1
3 Abbreviated terms .2
4 Pre-test considerations.3
4.1 Storage of nanomaterials .3
4.2 Storage containers.3
4.3 Handling of nanomaterials .3
5 Test sample.3
5.1 Aqueous dispersion .3
5.2 Aqueous extract .3
6 Preparation of test sample .3
6.1 Dispersion method .3
6.2 Extraction method .4
6.3 Concentration .4
6.4 Storage of test sample.4
6.5 Laboratory environment .4
7 Test methods .5
7.1 Principle.5
7.2 Alternative test methods.5
7.3 Selection and validation of the test method.6
7.4 Test procedures.6
8 Assessment of results .6
8.1 General .6
8.2 Guidance on application of test.7
9 Test report.7
Annex A (informative) Examples of potential interferences to LAL test.8
Annex B (informative) Gel-clot method .9
Annex C (informative) Endpoint photometric method .13
Annex D (informative) Kinetic method.16
Bibliography.19
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ISO 29701:2010(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 29701 was prepared by Technical Committee ISO/TC 229, Nanotechnologies.
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ISO 29701:2010(E)
Introduction
Endotoxins (lipopolysaccharides LPS) are part of the outer membrane of the cell wall of Gram-negative
bacteria such as E. coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus. Endotoxins can cause
a variety of systemic reactions in mammals, including humans, such as fever, disseminated intravascular
coagulation, hypotension, shock and death: the responses are mediated by production of various kinds of
cytokines, activation of the complement cascade, activation of the coagulation cascade, etc. Endotoxins are
present in the ordinary environment. Since most test samples of nanomaterials intended for in vitro and in vivo
test systems require various preparation procedures, endotoxins might contaminate the test nanomaterials if
the samples are prepared without special care.
For the purpose of toxicity screening or biocompatibility testing of nanomaterials, or mechanism studies on the
possible toxicity induced by nanomaterials, various cell-based in vitro test systems and in vivo animal models
are being developed and employed. In in vitro test systems, macrophages and other relevant mammalian cells
are frequently used as the test cells especially for nanomaterials because they are primarily the responsible
surveillance cells in the body. However, these cells are highly reactive to endotoxins; therefore it is difficult to
distinguish the response to endotoxins from that to nanomaterials. Consequently, contamination by
endotoxins would confound the result of tests in vitro.
Contamination by endotoxins of test samples may be reduced if appropriate precautions are followed in
preparation of the test sample. Therefore the preliminary detection of endotoxins is required to minimize the
contamination by endotoxins or confirm the insignificant levels of endotoxins in the test sample. It is also
important to quantify endotoxin levels for the adequate interpretation of data obtained by in vitro biological test
systems.
Since endotoxins may contaminate medical devices and medicines for parenteral use, quantitative and semi-
quantitative assay methods to test for endotoxins both in vivo and in vitro have been developed and used for
regulatory purposes as well as laboratory standard operational procedures for nanomaterials (see
Reference [6]). The bacterial endotoxin test using Limulus amebocyte lysate (LAL) reagent has been
developed as an in vitro assay method to test for the presence of endotoxin contamination as an alternative to
the pyrogenicity test using rabbits, and methods are described in the pharmacopoeia of many countries.
This International Standard provides considerations for the application of the LAL test to nanomaterial
samples intended for in vitro biological tests.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 29701:2010(E)
Nanotechnologies — Endotoxin test on nanomaterial samples
for in vitro systems — Limulus amebocyte lysate (LAL) test
1 Scope
This International Standard describes the application of a test using Limulus amebocyte lysate (LAL) reagent
for the evaluation of nanomaterials intended for cell-based in vitro biological test systems. The test is suitable
for use with nanomaterial samples dispersed in aqueous media, e.g. water, serum or reaction medium, and to
such media incubated with nanomaterials for an appropriate duration at 37 °C.
This International Standard is restricted to test samples for in vitro systems, but the methods can also be
adapted to nanomaterials to be administered to animals by parenteral routes.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
coagulogen
clottable protein in LAL which is known to play a central role in gel-clot formation by endotoxins
NOTE Coagulogen derived from Japanese horseshoe crab (Tachypleus tridentatus) consists of a total 175 amino
acids with the molecular weight of 19,723 (see Reference [7]).
2.2
coagulin
resulting fragments of coagulogen after limited proteolysis of clotting enzyme in LAL
NOTE A coagulin derived from Japanese horseshoe crab (Tachypleus tridentatus) consists of the N-terminal
fragment peptides (Ala1 – Arg18) and the C-terminal fragment peptides (Gly47 – Phe175) (see Reference [7]).
2.3
endotoxin
part of the outer membrane of the cell envelope of Gram-negative bacteria
NOTE The main active ingredient is lipopolysaccharides (LPS).
2.4
endotoxin unit
EU
standard unit of endotoxin activity
NOTE 1 The endotoxin unit was defined by the World Health Organization (WHO) Expert Committee on Biological
Standardization (ECBS) in 1996, relative to the activity of 0,1 ng of WHO reference standard endotoxin (RSE) from
Escherichia coli 0113:HK10:K(-) or 10 EU/ng (see Reference [8]).
NOTE 2 EU is equal to international unit (IU) of endotoxin.
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ISO 29701:2010(E)
2.5
lambda
λ
labelled sensitivity of LAL for gel-clot method or the lowest endotoxin concentration on the standard curve for
chromogenic or turbidimetric methods, expressed in EU/mL
2.6
Limulus amebocyte lysate
LAL
aqueous extract of the blood corpuscle of horseshoe crabs, Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus
2.7
Limulus amebocyte lysate test
LAL test
test for measuring bacterial endotoxins using Limulus amebocyte lysate reagent
NOTE The LAL test is called “bacterial endotoxin test (BET)” in pharmacopoeia.
2.8
optical density
OD
optical absorbance of an optical element for a given wavelength per unit distance
2.9
test sample
aqueous dispersion or aqueous extract of nanomaterials under investigation
3 Abbreviated terms
BET bacterial endotoxin test
CSE control standard endotoxin
ECBS expert committee on biological standardization
EF endotoxin-free
EU endotoxin unit
I/EC inhibition/enhancement control
LAL Limulus amebocyte lysate
LPS lipopolysaccharide
OD optical density
RSE reference standard endotoxin
WHO World Health Organization
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ISO 29701:2010(E)
4 Pre-test considerations
4.1 Storage of nanomaterials
Nanomaterials because of their high surface area can collect many of the contaminants including endotoxins
from the environment. For this reason, nanomaterials shall be collected and stored in endotoxin-free, sealable
containers (e.g. glassware) upon arrival until use. Suitable blanks such as endotoxin-free metal oxide powders
like titanium dioxide, silicon dioxide, etc. shall be used to verify the absence of endotoxin contamination.
NOTE 1 It is advisable that plastics like polypropylene be avoided for the storage of nanomaterials, due to the possible
interference with the LAL test as shown in Annex A.
NOTE 2 Endotoxin-free metal oxide powders can be obtained by heat-treatment (see 4.2).
4.2 Storage containers
Glassware and other heat stable storage containers for storage of nanomaterials and test samples should be
treated by heating to a temperature of greater than 250 °C for at least 30 min or other validated combinations
of temperature and time (e.g. 180 °C for at least 3 h, or 650 °C for 1 min) to eliminate endotoxins.
Commercially available sterile endotoxin-free polystyrene containers can be used.
4.3 Handling of nanomaterials
Dust found in the indoor environment usually contains significant amounts of endotoxins. Special attention
shall be paid to avoid contact between dust and nanomaterials during sampling and handling. A clean air
laboratory condition is required (recommended in 6.5).
5 Test sample
5.1 Aqueous dispersion
Nanomaterials which are dispersed in aqueous liquid may be subjected to the LAL test directly or after dilution
with endotoxin-free water.
5.2 Aqueous extract
Endotoxin-free reaction medium, physiological saline solution or other extraction vehicles incubated with
nanomaterials may be used as test sample for the LAL test.
6 Preparation of test sample
6.1 Dispersion method
Test dispersions might be prepared by one or more of the following:
⎯ hand grinding;
⎯ mechanical milling;
⎯ ultrasonication.
The dispersion medium will depend on the purpose and the particular in vitro test.
NOTE Nanomaterials can have high surface area, porosity, hydrophobicity and other properties that can make this
step difficult. Therefore, methods development might be required.
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ISO 29701:2010(E)
6.2 Extraction method
The extraction conditions, such as extraction medium, incubation time, incubation temperature and the
concentration of the test sample may simulate the incubation condition of the in vitro test concerned. Reaction
medium without pH indicator (e.g. phenol red) or buffered saline are preferable for the extraction medium to
avoid the interference with colour. The extraction medium should be certified endotoxin-free or reconstituted
from endotoxin-free reagents. Addition of antibiotics and antimycotics to the extraction medium might be
effective to prevent respectively bacterial and fungi growth. Interference effects of the added anti-biotic agents
to the LAL test should be validated (see 7.3.3). After extraction, the extraction mixture shall be centrifuged to
remove the particulates, and the supernatant, which shall serve as a test sample for the LAL test, should be
collected to endotoxin-free tubes or containers with endotoxin-free pipette tips. The extraction conditions
including centrifugation shall be justified and recorded. In particular, centrifugation condition shall be
determined according to the nanomaterials concerned.
NOTE 1 0,05 % polysorbate 20 is proposed as an extraction vehicle for airborne endotoxin from glass fibre filters (see
Reference [9]).
NOTE 2 0,1 % vitamin E surfactant (vitamin E d-α-tocopheryl polyethylene glycol-1000 succinate) was found to
improve the extraction of endotoxin from carbon nano-objects (see Reference [10]).
NOTE 3 For more information on the extraction methods, see ISO 10993-12:2007.
6.3 Concentration
Test sample shall be reconstituted in endotoxin-free water to the highest concentration in the cell-based in
vitro test concerned, if necessary.
6.4 Storage of test sample
The test sample shall, if possible, be tested as soon as possible after preparation because degradation of
endotoxins in the test sample or bacterial growth during storage can occur. The test sample shall be stored in
an endotoxin-free, sealable container (see 4.2) at a temperature of between 2 °C and 8 °C. If the test sample
is stored longer than 24 h, the stability and homogeneity of the test sample under the storage conditions shall
be verified.
6.5 Laboratory environment
6.5.1 Tap water and air cleanliness
Tap water and dust found in the indoor environment usually contain significant amounts of endotoxins.
Nanomaterials shall be processed with endotoxin-free medium and endotoxin-free laboratory-ware to ensure
aseptic sample preparation. A clean room, a clean air hood, or an equivalent clean air device with an air
cleanliness of ISO Class 5 (see ISO 14644-1) shall be used in laboratory circumstances where airborne
endotoxin contamination is a demonstrated problem, unless otherwise justified. For guidance on air
cleanliness, see ISO 14644-1, ISO 14644-2 and ISO 14644-7.
6.5.2 Equipment and laboratory-ware
Equipment and laboratory glassware used for the preparation of the test sample should be treated by heating
to a temperature of greater than 250 °C for at least 30 min or other validated combinations of temperature and
time (e.g. 180 °C for at least 3 h, and 650 °C for 1 min) to eliminate endotoxins. Heat-labile or other materials
which are not suitable for heat-treatment shall be treated with measures other than heat treatment to reduce
endotoxins. Rinsing with endotoxin-free water after soaking the materials in strong alkali or oxidizing solution
is a reliable method to remove endotoxins. If strong alkali or an oxidizing solution is used, the method needs
to be validated to ensure that the method reduces the presence of endotoxins and that no residuals remain
after treatment that interfere with the test. With respect to heat-labile laboratory-ware such as containers,
tubes, tips for micropipettes, endotoxin-free plastic products are commercially available.
NOTE It is advisable to use polystyrene products when plastic products are used.
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6.5.3 Rinse water
Water is one of the sources of endotoxins detected in equipment and laboratory-ware. Distilled water may be
used for rinsing the equipment and laboratory-ware after endotoxin reduction treatments. However, distilled
water prepared in-house might be contaminated with endotoxins due to inadequate equipment or
inappropriate handling, although distillation has been shown to be effective in removing endotoxins from
contaminated water (see Reference [11]). The endotoxin level in the distilled water prepared in-house shall be
measured periodically to validate that it contains insignificant levels of endotoxins. If endotoxin contamination
in distilled water is unavoidable, commercially available endotoxin-free water should be used.
7 Test methods
7.1 Principle
Endotoxins activate a factor in the LAL and trigger a proteolytic cascade (see Reference [12]). The clotting
enzyme, which is released from the proclotting enzyme by one of the activated factors, catalyses a proteolysis
of coagulogen in the LAL and the resulting fragments, coagulins, spontaneously bind to each other through
disulfide linkage to develop the turbidity of the LAL and finally form a gel-clot. The gel-clot formation is
principally determined by visual inspection after inverting test tubes. This method requires no optical reader
and the procedures are easy to perform. The most sensitive gel-clot method using commercially available
reagents measures 0,015 EU/mL.
NOTE One of the practical procedures for the gel-clot method is described in Annex B.
7.2 Alternative test methods
7.2.1 Endpoint photometric methods
The optical density (OD) of the reaction mixture is measured after a certain period of reaction time. With
regard to endpoint photometric methods, there are two techniques; the turbidimetric technique measuring the
turbidity of the reaction mixture and the chromogenic technique measuring p-nitroaniline (p-NA) liberated from
a synthetic substrate, such as Boc-Leu-Gly-Arg-p-NA or Boc-Thr-Gly-Arg-p-NA for the clotting enzyme. Due to
the low sensitivity and a technical difficulty stopping the progress of turbidity generation at a designated time
point, the simple turbidimetric method is replaced with the kinetic turbidimetric method described in 7.2.2.
There are at least two procedures for measuring p-NA in the reaction mixture:
⎯ one measures the OD of p-NA directly at a wavelength of 405 nm, and
⎯ the other measures the diazotized magenta derivative of p-NA photometrically at a wavelength of
between 540 nm and 550 nm.
The sensitivity of endpoint photometric method using commercially available reagents by measuring the OD at
a wavelength of 405 nm is 0,01 EU/mL while that of the diazo-coupling method is 0,001 EU/mL.
NOTE One of the practical procedures for the endpoint photometric method is described in Annex C.
7.2.2 Kinetic methods
The time required to reach the predetermined OD of the reaction mixture or the rate of colour or turbidity
development is determined by an optical reader. With regard to kinetic procedures, the OD of p-NA liberated
from the synthetic peptide stated above or turbidity of the reaction mixture is read at multiple time points as
the reaction proceeds, and thus several types of automated instruments have been developed. To detect
endotoxins more precisely and accurately with kinetic methods, sophisticated automated instruments are
necessary. The best sensitivity of the kinetic method using a commercially available automated instrument is
0,001 EU/mL.
NOTE One of the practical procedures for the kinetic method is described in Annex D.
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ISO 29701:2010(E)
7.3 Selection and validation of the test method
7.3.1 Considerations of minimum required sensitivity
The critical concentration for endotoxins in in vitro test systems to produce biological reactions varies
according to the in vitro test systems employed; 0,01 ng of endotoxin/mL induced IL-1β and TNF-α in human
macrophages (see Reference [13]) whereas 0,048 ng of endotoxin induced insignificant biological responses
in human dendritic cells or peripheral blood mononuclear cells (see Reference [13]). It is highly desirable to
know the allowable contamination level of endotoxins in in vitro test systems to select the appropriate LAL test.
The sensitivity of the LAL reagent should be better than or at least equivalent to the allowable contamination
level in the in vitro test concerned.
7.3.2 Inhibition/enhancement potential to test by test sample
7.3.2.1 It is reported that several materials interfere with the LAL test. Some nanomaterials may have
been recently synthesized and have unknown inhibition/enhancement potential on the LAL test due to their
properties.
NOTE Examples of potential interferences are available in Annex A.
7.3.2.2 Interference by colour or turbidity of the test sample is a matter of concern when endpoint
photometric methods or kinetic methods are employed. The test method should be selected according to the
optical feature of the test sample.
7.3.3 Validation of test method
7.3.3.1 The interfering effects of nanomaterials on the endotoxin test can be examined by testing a series
of dilutions of the test sample with and without a known amount of spike endotoxin.
NOTE 1 The guidance procedures for the validation of test methods are described in Annexes B, C and D.
NOTE 2 For information on the validation of test methods, see pharmacopoeia (e.g. References [26], [27] and [28]).
7.3.3.2 The optimum pH for the LAL reaction is between 6 and 8. A pH measurement shall be taken on
the reaction mixture consisting of the test sample and lysate using an appropriate pH test system when the
test is inhibited. If pH adjustment is necessary, adjust the pH of the test sample so that the pH of the reaction
mixture falls within the above pH range.
NOTE 1 For pH adjustment purposes, endotoxin-free tris hydroxymethyl aminomethane (TRIS) buffer, 0,1N NaOH or
0,1N HCl may be used.
NOTE 2 Salts resulting through pH adjustment can interfere with the LAL reaction (see Annex A).
7.4 Test procedures
One of the test methods described as “Bacterial endotoxin tests” or “Bacterial endotoxins” in the current
version of the European, Japanese or United States Pharmacopoeia, shall be used.
8 Assessment of results
8.1 General
When assessing the results of the LAL test on nanomaterials, good scientific judgment should be applied,
keeping in mind the limitation of the test. It is especially important to consider the nature of any interference of
the test nanomaterials on the LAL test. In such cases, the acceptable limitation of the interfering effects shall
be discussed and careful interpretation of data shall be made.
6 © ISO 2010 – All rights reserved
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ISO 29701:2010(E)
8.2 Guidance on application of test
8.2.1 If interference cannot be successfully overcome by dilution of the test sample or by other measures,
the LAL test cannot be applied to such test sample.
8.2.2 When contamination by endotoxins is inevitable, treatment of the test sample with reagents such as
polymyxin B can be applied to eliminate the effects by endotoxins (see References [15] and [16]).
8.2.3 It is well known that serum may be contaminated with β-1,3-glucan which originates from yeast, fungi
or other microbes and that an ordinary LAL reagent reacts with β-1,3-glucan in addition to endotoxins (see
Reference [12]). Thus, it is highly recommended to use β-1,3-glucan-free serum for the preparation of test
samples, if necessary. Endotoxin-specific LAL reagents which do not react with β-1,3-glucan should be used
when β-1,3-glucan contamination is suspected.
9 Test report
9.1 The test report shall be in accordance with the test procedures used.
9.2 The test report shall include the following:
a) test results;
b) test procedures;
c) complete identification of the nanomaterials tested;
d) procedures for test sample preparation, storage condition of the test sample and information on the
classification of the laboratory environment used;
e) identification of the LAL reagent (trade-name, manufacturer's code, catalogue or formulation number,
batch number or date of manufacture, sensitivity, etc.);
f) identification of standard endotoxin (trade-name, manufacturer's code, catalogue or formulation number,
batch number or date of manufacture, potency, etc.);
g) validity of the test including interference by the test sample.
NOTE For information on the records, see ISO 10993-12:2007.
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NORME ISO
INTERNATIONALE 29701
Première édition
2010-09-15
Nanotechnologies — Essai de détection
d'endotoxines sur des échantillons
de nanomatériaux pour des systèmes
in vitro — Essai au lysat d'amébocytes
de Limule (LAL)
Nanotechnologies — Endotoxin test on nanomaterial samples for
in vitro systems — Limulus amebocyte lysate (LAL) test
Numéro de référence
ISO 29701:2010(F)
©
ISO 2010
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ISO 29701:2010(F)
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Version française parue en 2011
Publié en Suisse
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ISO 29701:2010(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Termes et définitions .1
3 Termes abrégés .2
4 Considérations préalables à l'essai.3
4.1 Conservation des nanomatériaux.3
4.2 Récipients.3
4.3 Manipulation des nanomatériaux .3
5 Échantillon à soumettre à essai.3
5.1 Dispersion aqueuse .3
5.2 Extrait aqueux.3
6 Préparation de l'échantillon à soumettre à essai.3
6.1 Méthode de dispersion .3
6.2 Méthode d'extraction.4
6.3 Concentration .4
6.4 Conservation de l'échantillon à soumettre à essai.4
6.5 Environnement du laboratoire .4
7 Méthodes d'essai.5
7.1 Principe.5
7.2 Autres méthodes d'essai .5
7.3 Sélection et validation de la méthode d'essai .6
7.4 Modes opératoires de l'essai .7
8 Évaluation des résultats .7
8.1 Généralités .7
8.2 Recommandations concernant l'application de l'essai.7
9 Rapport d'essai.7
Annexe A (informative) Exemples d'interférences potentielles dans l'essai LAL.9
Annexe B (informative) Méthode dite de coagulation .10
Annexe C (informative) Méthode photométrique.14
Annexe D (informative) Méthode cinétique .17
Bibliographie.20
© ISO 2010 – Tous droits réservés iii
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ISO 29701:2010(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 29701 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 229, Nanotechnologies.
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ISO 29701:2010(F)
Introduction
Les endotoxines (lipopolysaccharides LPS) sont l'un des constituants de la membrane externe de la paroi
cellulaire de bactéries Gram-négatif telles que E. coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria et
Haemophilus. Chez les mammifères, entre autres les humains, elles peuvent être la cause de nombreuses
réactions systémiques, telles que la fièvre, le syndrome de coagulation intravasculaire disséminée,
l'hypotension, l'état de choc et le décès: les réponses sont déclenchées par la production de diverses sortes
de cytokines, l'activation rapide du complément, l'activation rapide de la coagulation, etc. Les endotoxines
sont présentes naturellement dans l'environnement. La plupart des échantillons de nanomatériaux destinés à
des systèmes d'essai in vitro et in vivo nécessitant divers modes opératoires de préparation, des endotoxines
peuvent contaminer ces nanomatériaux si les échantillons sont préparés sans y porter une attention
particulière.
De nombreux systèmes d'essais sur cultures cellulaires in vitro et modèles animaux in vivo ont été
développés et utilisés en vue d'effectuer des dépistages de toxicité ou de tester la biocompatibilité des
nanomatériaux, ou d'effectuer des études de mécanisme de la toxicité éventuelle induite par des
nanomatériaux. Dans le cadre de systèmes d'essai in vitro, des macrophages et autres cellules spécifiques
de mammifères sont fréquemment utilisées en tant que cellules d'essai, notamment pour les nanomatériaux
car elles représentent les principales cellules de protection de l'organisme. Toutefois, ces cellules sont
éminemment réactives aux endotoxines, il est donc difficile de distinguer leur réponse aux endotoxines de
celle aux nanomatériaux. En conséquence, une contamination par des endotoxines fausserait le résultat
d'essais in vitro.
La contamination des échantillons d'essai par des endotoxines peut être réduite si des précautions adéquates
sont mises en œuvre lors de la préparation de ces échantillons. Ainsi, la détection préalable d'endotoxines est
nécessaire en vue d'en minimiser la contamination ou pour confirmer des niveaux non significatifs
d'endotoxines dans l'échantillon d'essai. Il est également important de les quantifier en vue d'une
interprétation adéquate des données obtenues dans les systèmes d'essai biologique in vitro.
Les endotoxines étant susceptibles de contaminer des instruments médicaux et des médicaments destinés à
une administration parentérale, des méthodes d'essai quantitative et semi-quantitative in vivo et in vitro ont
été développées pour tester la présence des endotoxines et sont utilisées à des fins réglementaires et en tant
que procédures opératoires de laboratoire standardisées concernant les nanomatériaux (voir Référence [6]).
Un essai portant sur les endotoxines bactériennes utilisant le réactif LAL (lysat d'amébocytes de Limule) a été
développé sous la forme d'une méthode d'essai in vitro destinée à tester la présence d'une contamination par
des endotoxines afin d'offrir une alternative à l'essai de pyrogénicité sur des lapins. Ces méthodes sont
décrites dans les pharmacopées de nombreux pays.
La présente Norme internationale fournit des considérations concernant l'application de l'essai LAL aux
échantillons de nanomatériaux destinés aux essais biologiques in vitro.
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NORME INTERNATIONALE ISO 29701:2010(F)
Nanotechnologies — Essai de détection d'endotoxines sur
des échantillons de nanomatériaux pour des systèmes
in vitro — Essai au lysat d'amébocytes de Limule (LAL)
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit l'application d'un essai utilisant le réactif LAL (lysat d'amébocytes de
limule) en vue d'évaluer des nanomatériaux destinés à des systèmes d'essai biologique sur cultures
cellulaires in vitro. L'essai est approprié à une utilisation avec des échantillons de nanomatériaux dispersés
dans un milieu aqueux, par exemple de l'eau, du sérum physiologique ou un milieu de réaction, ainsi qu'à des
milieux incubés avec des nanomatériaux pendant un temps donné à 37 °C.
La présente Norme internationale est conçue pour des échantillons destinés à des systèmes in vitro, toutefois,
les méthodes peuvent également être adaptées à des nanomatériaux étant administrés à des animaux par
voies parentérales.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
coagulogène
protéine coagulable du LAL, connue pour jouer un rôle central dans la coagulation du lysat par les
endotoxines
NOTE Un coagulogène dérivé de la Limule (Japanese horseshoe crab: Tachypleus tridentatus) se compose d'un
total de 175 acides aminés pour un poids moléculaire de 19 723 (voir Référence [7]).
2.2
coaguline
fragments résultant du coagulogène après protéolyse limitée de l'enzyme de coagulation du LAL
NOTE Une coaguline dérivée de la Limule (Japanese Horseshoe Crab: Tachypleus tridentatus) se compose de
fragments peptidiques N-terminaux (Ala1 – Arg18) et de fragments peptidiques C-terminaux (Gly47 – Phe175) (voir
Référence [7]).
2.3
endotoxine
partie de la membrane externe d'une enveloppe cellulaire de bactérie à Gram-négatif
NOTE Les principaux principes actifs sont les lipopolysaccharides (LPS).
2.4
unité d'endotoxine
UE
unité normalisée de l'activité d'endotoxine
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ISO 29701:2010(F)
NOTE 1 L'unité d'endotoxine a été définie par le Comité d'Experts de la Standardisation Biologique (CESB) de l'OMS
en 1996 relative à l'activité de 0,1 ng de l'endotoxine de référence d'Escherichia coli 0113:HK10:K(-) ou 10 UE/ng (voir
Référence [8]).
NOTE 2 UE équivaut à l'unité internationale (UI) de l'endotoxine.
2.5
lambda
λ
marque de sensibilité du LAL pour la méthode de coagulation ou pour la plus basse concentration en
endotoxines sur la courbe de référence des méthodes chromogéniques ou turbidimétriques, exprimée en
UE/ml
2.6
lysat d'amébocytes de Limule
LAL
extraits aqueux de globules sanguins provenant de la Limule, Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus
2.7
lysat d'amébocytes de Limule
essai LAL
essai destiné au mesurage des endotoxines bactériennes au moyen d'un réactif de lysat d'amébocytes de
Limule
NOTE L'essai LAL est désigné par «Essai de détection des endotoxines bactériennes (BET)» dans la pharmacopée.
2.8
densité optique
DO
absorbance optique d'un élément optique pour une longueur d'onde donnée par unité de distance
2.9
échantillon à soumettre à essai
dispersion aqueuse ou extrait aqueux de nanomatériaux à soumettre à essai
3 Termes abrégés
BET essai de détection des endotoxines bactériennes
CESB comité d'experts de la standardisation biologique
CSE étalon d'endotoxine de contrôle lyophilisé
DO densité optique
EF exempt d'endotoxines
I/EC contrôle de l'inhibition/exacerbation
LAL lysat d'amébocytes de Limule
LPS lipopolysaccharide
OMS Organisation Mondiale de la Santé
RSE étalon d'endotoxine de référence
UE unité d'endotoxine
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4 Considérations préalables à l'essai
4.1 Conservation des nanomatériaux
En raison de leur importante surface, les nanomatériaux peuvent collecter de nombreux contaminants dont
les endotoxines de l'environnement. Par conséquent, entre le moment de leur réception et de leur utilisation,
les nanomatériaux doivent être collectés et conservés dans des récipients hermétiques exempts
d'endotoxines (par exemple des récipients en verre). Des échantillons témoins, tels que des poudres d'oxyde
de métal exemptes d'endotoxines comme le dioxyde de titane, le dioxyde de silicium, etc., doivent être utilisés
pour vérifier l'absence de contamination par les endotoxines.
NOTE 1 Il est préférable d'éviter les plastiques tels que le polypropylène pour la conservation de nanomatériaux en
raison de l'éventuelle interférence avec l'essai LAL, comme indiqué dans l'Annexe A.
NOTE 2 Les poudres d'oxyde de métal exemptes d'endotoxines peuvent être obtenues par traitement thermique
(voir 4.2).
4.2 Récipients
Il convient de soumettre à essai la verrerie et les autres récipients thermostables utilisés pour la conservation
des nanomatériaux et des échantillons à une température supérieure à 250 °C pendant au moins 30 min ou à
toute autre combinaison de température et de temps validée (par exemple durant au moins 3 h à 180 °C et
durant 1 min à 650 °C) afin d'éliminer les endotoxines. Il est possible d'utiliser des récipients stériles en
polystyrène exempts d'endotoxine disponibles dans le commerce.
4.3 Manipulation des nanomatériaux
La poussière présente dans l'environnement intérieur contient habituellement des quantités significatives
d'endotoxines. Le contact entre la poussière et les nanomatériaux au cours de l'échantillonnage et de la
manipulation doit être évité avec soin. L'air du laboratoire doit être propre (recommandation de 6.5).
5 Échantillon à soumettre à essai
5.1 Dispersion aqueuse
Les nanomatériaux dispersés dans un liquide aqueux peuvent être soumis directement à un essai LAL ou
après dilution dans une eau exempte d'endotoxines.
5.2 Extrait aqueux
Un milieu de réaction exempt d'endotoxines, une solution saline physiologique ou d'autres milieux d'extraction
incubés avec des nanomatériaux peuvent servir d'échantillon à soumettre à essai pour un essai LAL.
6 Préparation de l'échantillon à soumettre à essai
6.1 Méthode de dispersion
Les dispersions à soumettre à essai peuvent être préparées par
⎯ broyage manuel,
⎯ fraisage mécanique, et/ou
⎯ ultrasonication.
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Le milieu de dispersion dépendra de l'objectif et de l'essai in vitro particulier.
NOTE Les nanomatériaux peuvent présenter une surface importante, une porosité ou une hydrophobie ainsi que
d'autres propriétés susceptibles de rendre cette étape difficile. Il peut être, en conséquence, nécessaire de développer
d'autres méthodes.
6.2 Méthode d'extraction
Les conditions d'extraction, telles que le milieu d'extraction, le temps d'incubation, la température d'incubation
et la concentration de l'échantillon à soumettre à essai peuvent simuler les conditions d'incubation de l'essai
in vitro concerné. Un milieu de réaction sans indicateur de pH (par exemple du rouge de phénol) ou une
solution physiologique tamponnée sont préférés en tant que milieu d'extraction afin d'éviter toute interférence
de couleur. Il convient que le milieu d'extraction soit certifié exempt d'endotoxines ou reconstitué à partir de
réactifs exempts d'endotoxines. L'ajout d'antibiotiques et d'antimycosiques au milieu d'extraction peut être
efficace pour empêcher respectivement la croissance bactérienne et fongique. Il convient que les effets
d'interférence dus aux agents antibiotiques ajoutés à l'essai LAL soient validés (voir 7.3.3). Une fois
l'extraction effectuée, le mélange d'extraction doit être centrifugé et il convient de récupérer le surnageant,
servant d'échantillon pour l'essai LAL, dans des tubes ou des récipients à l'aide d'embouts de pipette, le tout
étant exempt d'endotoxine. Les conditions d'extraction, notamment de centrifugation, doivent être justifiées et
consignées. Les conditions de centrifugation doivent notamment être déterminées en fonction des
nanomatériaux concernés.
NOTE 1 Le polysorbate 20 à 0,05 % est suggéré en tant que vecteur d'extraction pour une endotoxine dans l'air à
partir de filtres en fibre de verre (voir Référence [9]).
NOTE 2 Un tensioactif à base de vitamine E à 0,1 % (vitamine E d-α-tocophéryl polyéthylène glycol-1000 succinate)
s'est avéré améliorer l'extraction des endotoxines à partir de nano-objets en carbone (voir Référence [10]).
NOTE 3 Pour de plus amples informations concernant les méthodes d'extraction, voir l'ISO 10993-12:2007.
6.3 Concentration
L'échantillon à soumettre à essai doit être préparé à la plus haute concentration possible dans une eau
exempte d'endotoxines pour l'essai sur culture cellulaire in vitro concerné, le cas échéant.
6.4 Conservation de l'échantillon à soumettre à essai
Si possible, l'échantillon doit être soumis à essai dès que possible une fois la préparation effectuée afin
d'éviter une dégradation des endotoxines ou une croissance bactérienne pouvant survenir lors de la
conservation. L'échantillon doit être conservé dans un récipient hermétique et exempt d'endotoxines (voir 4.2)
à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Si un échantillon à soumettre à essai est conservé plus de
24 h, la stabilité et l'homogénéité de l'échantillon à soumettre à essai dans les conditions de conservation
doivent être vérifiées.
6.5 Environnement du laboratoire
6.5.1 Eau du robinet et propreté de l'air
L'eau du robinet et la poussière présente dans l'environnement intérieur contiennent habituellement des
quantités significatives d'endotoxines. Les nanomatériaux doivent être manipulés dans un milieu et dans de la
verrerie de laboratoire exempts d'endotoxines afin de garantir une préparation aseptisée de l'échantillon. Sauf
justification contraire, une salle blanche, une hotte à air propre ou un dispositif équivalent de purification de
l'air de classe ISO 5 (voir l'ISO 14644-1) doivent être utilisés en laboratoire si une contamination par des
endotoxines dans l'air est avérée. Pour des recommandations concernant le dispositif de purification de l'air,
voir l'ISO 14644-1, l'ISO 14644-2 et l'ISO 14644-7.
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6.5.2 Matériel et verrerie de laboratoire
Il convient de soumettre à essai le matériel et la verrerie destinés à la préparation d'échantillons à une
température supérieure à 250 °C pendant au moins 30 min ou à une autre combinaison de température et de
temps validée (par exemple durant au moins 3 h à 180 °C et durant 1 min à 650 °C) afin d'éliminer les
endotoxines. Les matériaux thermolabiles ou autres ne pouvant pas être soumis à un traitement thermique
doivent être traités au moyen d'autres mesures visant à éliminer les endotoxines. Une méthode adéquate
d'élimination des endotoxines consiste à rincer les matériaux au moyen d'eau exempte d'endotoxines après
trempage dans une solution oxydante ou fortement alcaline. En cas d'utilisation d'une solution fortement
alcaline ou oxydante, la méthode doit être validée afin de garantir qu'elle réduit la présence d'endotoxines et
qu'aucun résidu restant au terme du traitement n'interfère avec l'essai. En ce qui concerne les verreries
thermolabiles, telles que des récipients, des tubes, des embouts de micropipettes, des produits en matière
plastique exempts d'endotoxines sont disponibles dans le commerce.
NOTE Il est préférable d'utiliser des produits en polystyrène en cas d'utilisation de produits en matière plastique.
6.5.3 Eau de rinçage
L'eau est l'une des sources d'endotoxines avérées dans le matériel et la verrerie de laboratoire. L'eau distillée
peut être utilisée pour rincer le matériel et la verrerie après des traitements d'élimination des endotoxines.
Toutefois, l'eau distillée préparée dans le laboratoire peut être contaminée par des endotoxines en raison d'un
matériel inadapté ou d'une manipulation inappropriée, bien que la distillation se soit avérée efficace dans
l'élimination des endotoxines provenant d'une eau contaminée (voir Référence [11]). Le niveau d'endotoxines
dans l'eau distillée préparée dans le laboratoire doit être mesuré périodiquement afin de valider qu'il n'est pas
significatif. Si la contamination par des endotoxines de l'eau distillée est inévitable, il convient d'utiliser de
l'eau exempte d'endotoxines disponible dans le commerce.
7 Méthodes d'essai
7.1 Principe
Les endotoxines activent un facteur du LAL, déclenchant des effets protéolytiques rapides (voir Référence [12]).
L'enzyme de coagulation, qui est libérée de l'enzyme de pré-coagulation par l'un des facteurs activés, catalyse
la protéolyse du coagulogène du LAL et les fragments obtenus, les coagulines, se lient spontanément les unes
aux autres par une liaison disulfure entraînant la turbidité du LAL puis, finalement, entraîne la coagulation du
lysat. La formation de ce gel de coagulation du lysat est principalement déterminée par une inspection visuelle
par retournement des tubes à essai. Cette méthode n'implique aucun lecteur optique et les modes opératoires
sont simples à réaliser. La méthode de coagulation présentant la plus grande sensibilité reposant sur
l'utilisation de réactifs disponibles dans le commerce permet un mesurage de 0,015 UE/ml.
NOTE Un des modes opératoires pratiques pour la méthode de coagulation du lysat est décrit dans l'Annexe B.
7.2 Autres méthodes d'essai
7.2.1 Méthodes photométriques
La densité optique (DO) du mélange de réaction est mesurée après un certain temps de réaction. Deux
techniques photométriques sont disponibles: la technique turbidimétrique consistant à mesurer la turbidité du
mélange réactif et la technique chromogénique consistant à mesurer la p-nitroaniline (p-NA) libérée à partir
d'un substrat synthétique tel que Boc-Leu-Gly-Arg-p-NA ou Boc-Thr-Gly-Arg-p-NA pour l'enzyme de coagulation.
En raison de la faible sensibilité et de la difficulté technique à arrêter la progression de la turbidité à un temps
précis, la méthode turbidimétrique simple est remplacée par la méthode turbidimétrique cinétique décrite en
7.2.2. Il existe au moins deux modes opératoires permettant de mesurer la p-NA dans le mélange de réaction:
⎯ l'une mesure la DO de la p-NA directement à une longueur d'ondes de 405 nm;
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⎯ l'autre effectue un mesurage photométrique du dérivé magenta diazoté de la p-NA à des longueurs
d'onde allant de 540 nm à 550 nm.
La sensibilité de la méthode photométrique reposant sur des réactifs disponibles dans le commerce et visant
à mesurer la DO à une longueur d'ondes de 405 nm est de 0,01 UE/ml, alors que la méthode par couplage
diazoïque donne 0,001 UE/ml.
NOTE Un des modes opératoires pratiques pour la méthode photométrique est décrit dans l'Annexe C.
7.2.2 Méthodes cinétiques
Le temps nécessaire pour atteindre la DO prédéterminée du mélange de réaction, le taux de coloration ou le
développement de la turbidité sont déterminés par un lecteur optique. En ce qui concerne les modes
opératoires cinétiques, la DO de la p-NA libérée du peptide synthétique définie précédemment ou la turbidité
du mélange de réaction est lue à différents temps au cours de la réaction, différents types d'automates ont
ainsi été développés. Du matériel automatisé et sophistiqué est nécessaire pour effectuer une détection plus
précise des endotoxines, particulièrement avec des méthodes cinétiques. La sensibilité la plus basse de la
méthode cinétique au moyen de matériel automatisé disponible dans le commerce est de 0,001 UE/ml.
NOTE Un de ces modes opératoires pratiques pour la méthode cinétique est décrite dans l'Annexe D.
7.3 Sélection et validation de la méthode d'essai
7.3.1 Considérations concernant la sensibilité minimale requise
La concentration critique en endotoxines dans des systèmes d'essai in vitro pour produire des réactions
biologiques varie en fonction des systèmes d'essai in vitro utilisés; 0,01 ng d'endotoxine/ml induisait une IL-1β
et un TNF-α dans des macrophages humains (voir Référence [13]) alors que 0,048 ng d'endotoxine induisait
des réponses biologiques non significatives dans des cellules dendritiques humaines ou des cellules
mononucléaires du sang périphérique (voir Référence [13]). Il est éminemment souhaitable de connaître le
niveau de contamination par des endotoxines autorisé dans les systèmes d'essai in vitro afin de sélectionner
l'essai LAL adéquat. Il convient que la sensibilité du réactif LAL soit inférieure ou au moins équivalente au
niveau de contamination autorisé pour l'essai in vitro concerné.
7.3.2 Inhibition/exacerbation potentielle de l'essai par l'échantillon
7.3.2.1 Les interférences de plusieurs matériaux avec l'essai LAL ont été consignées. Certains
nanomatériaux peuvent avoir été récemment synthétisés et avoir un potentiel inconnu
d'inhibition/exacerbation de l'essai LAL dû à leurs propriétés.
NOTE Des exemples d'interférences potentielles sont disponibles dans l'Annexe A.
7.3.2.2 L'interférence sur la couleur ou la turbidité de l'échantillon à soumettre à essai est une
préoccupation lors de la mise en œuvre de méthodes photométriques ou de méthodes cinétiques. Il convient
que la méthode expérimentale soit sélectionnée conformément aux caractéristiques optiques de l'échantillon.
7.3.3 Validation de la méthode d'essai
7.3.3.1 Les interférences des nanomatériaux sur un essai d'endotoxines peuvent être examinées en
soumettant à essai une série de dilutions d'échantillons avec et sans une quantité connue d'endotoxines en
excès.
NOTE 1 Les modes opératoires pour la validation des méthodes expérimentales sont décrits dans les Annexes B, C et D.
NOTE 2 Pour de plus amples informations concernant la validation des méthodes expérimentales, se reporter à la
Pharmacopée (voir Références [26], [27] et [28]).
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7.3.3.2 La réaction LAL survient de manière optimale à un pH compris entre 6 et 8. Un mesurage du pH
doit être effectué sur le mélange de réaction se composant d'échantillon à soumettre à essai et de lysat au
moyen d'un système approprié mesurant le pH lorsque l'essai est inhibé. Si des ajustements du pH sont
nécessaires, ajuster le pH de l'échantillon de sorte que le pH du mélange de réaction s'inscrive dans la plage
de pH précédemment mentionnée.
NOTE 1 Il est possible d'utiliser un tampon trishydroxyméthylaminométhane (Tris), NaOH 0,1 N ou du HCI 0,1 N pour
ajuster le pH.
NOTE 2 Le
...
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